高表达UBE2B在食管癌中的临床意义及其与免疫浸润相关性*

钱晓瑜 卢志华 冯 洋 包一笑 许丁文

扬州市职业大学医学院,江苏省扬州市 225100

食管癌是常见的胸部恶性肿瘤,包括食管鳞状细胞癌和腺癌。对可切除的食管癌病变,主要采用手术治疗[1],但仅靠手术切除并不能达到满意的疗效。数据显示,患者手术治疗后局部复发和远处转移的概率较高,手术后近5年的生存率仅为30%左右[2]。随着肿瘤免疫学研究的深入,免疫治疗已成为降低食管癌患者总体死亡率的有效手段。免疫治疗表现出特异性强、毒副作用小等优点,其可通过调节机体的特异性抗肿瘤免疫反应能力,起到消除肿瘤细胞扩散或转移的作用[3],寻找食管癌的免疫治疗靶点对于提高治疗效果和增加生存率有重要意义。

组蛋白泛素化在调节DNA修复系统之间的相互作用中起着重要作用。UBE2B是泛素结合酶,参与RAD18介导的H2B和增殖细胞核抗原(PNCA)的泛素化,通过激活DNA聚合酶的DNA损伤耐受性绕过DNA复制介导的单链断裂[4]。研究表明,UBE2B与多种肿瘤的发生发展密切相关。比如,UBE2B通过促进RAD18介导的ZMYM2单泛素化和稳定化促进食管癌生长[5]。在结直肠癌中,UBE2B的过度表达与术前患者的不良反应和低生存率有关[6]。UBE2B缺失通过抑制WNT/β-Catenin信号来破坏黑色素瘤表型的表达[7]。在三阴性乳腺癌中,UBE2B通过影响DNA跨损伤合成(translesion synthesis)介导顺铂耐药[8]。但是关于UBE2B与食管癌的研究尚未明确。因此,本文运用生物信息学的方法,分析UBE2B对食管癌的作用,为食管癌治疗靶点的挖掘提供参考。

1 材料与方法

1.1 UBE2B在食管癌中的表达分析 利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)工具中的 TCGA Gene analysis功能分析UBE2B在TCGA食管癌样本中的表达情况,UBE2B的表达量以TPM(transcript per million)表示。

1.2 UBE2B表达量与食管癌患者预后相关性分析 通过PrognoScan(http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html)分析GEO数据库中的GSE11595数据集高表达或低表达UBE2B与食管癌总体生存率相关性分析。利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析工具UBE2B的表达量与TCGA样本中所有食管癌患者的总体生存率(OS)相关性。再通过Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis)进行高表达或低表达UBE2B与食管腺癌或者鳞癌患者OS相关性分析。

1.3 UBE2B在放化疗食管癌患者中的表达以及化疗敏感性分析 食管癌患者术后放疗数据来自TCGA,通过cBioPortal(https://www.cbioportal.org/)下载,利用非配对T检验进行分析。化疗敏感及耐药数据来自GEO公共数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中的GSE13525数据集,下载提取UBE2B表达数据后进行非配对T检验分析。运用DepMap平台分析CCLE细胞数据库 (https://depmap.org/portal/)食管癌细胞系中UBE2B的基因效应(gene effect)与常用的食管癌化疗药物敏感性的相关性[9]。

1.4 UBE2B表达与食管癌免疫浸润相关性分析 利用HPA数据库(https://www.proteinatlas.org/)中Immune菜单分析UBE2B在HPA dataset和Monaco dataset两个免疫细胞数据集中的表达。利用TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析UBE2B表达与食管癌免疫细胞浸润相关性,通过GEPIA在线工具验证UBE2B与中性粒细胞标志分子CD66B(CEACAM8)以及CD11B(ITGAM)以及免疫检查点(check points) PD-1(PDCD1)、PD-L1(CD274)、CTLA4的相关性。

1.5 抑制UBE2B的化合物及药物预测 通过比较毒物基因组学数据库(Comparative Toxicogenomics Database,CTD base;https://ctdbase.org/)预测抑制UBE2B的表达或活性的化合物及药物,然后通过cytoscape(https://cytoscape.org/)进行可视化。

2 结果

2.1 UBE2B在食管癌组织中的表达 通过UALCAN工具挖掘TCGA数据分析发现,UBE2B在食管癌中的表达显著高于正常食管组织(P<0.05),见图1a。而且,亚洲人种的表达要显著高于高加索人种(P<0.05),见图1b,食管癌的2、3、4分期要显著高于1期的(P<0.05),见图1c;淋巴结转移的(N1、N2、N3)要显著高于无淋巴结转移(N0)的(P<0.05),见图1d。

图1 食管癌UBE2B mRNA表达分析

2.2 UBE2B与食管癌患者生存预后相关性分析 prognoscan分析GEO数据集GSE11595也显示,UBE2B高表达与患者的低总体生存率(OS)显著相关(P<0.05),见图2a。通过GEPIA分析TCGA食管癌患者数据发现,UBE2B高表达与患者的低总体生存率显著相关(P<0.05),见图2b。进一步通过Kaplan-Meier Plotter分析发现,UBE2B高表达与腺癌患者的低总体生存率显著相关(P<0.05),见图2c,而鳞癌的低总体生存率无显著性(P=0.081),见图2d。

图2 UBE2B表达量与食管癌患者生存率相关性

图3 UBE2B与食管癌放化疗效果相关性分 析

2.3 UBE2B与食管癌放化疗相关性分析 肿瘤的治疗是影响患者预后的重要因素。我们接着研究UBE2B对食管癌患者放疗、化疗影响。TCGA数据显示,术后放疗的患者UBE2B显著低于未放疗的患者(P<0.05),见图3a,说明UBE2B可能是放疗的靶基因。此外,GEO数据GSE45670显示,放化疗无反应(non-responder)的患者UBE2B显著高于放化疗有反应(responder)的患者(P<0.05),见图3b,而且ROC曲线显示UBE2B可以作为判断食管癌患者放化疗反应的有效标志物(AUC=0.77,P<0.05),见图3c。此外,CCLE细胞数据库也显示,在食管癌细胞系中,UBE2B的基因效应(gene effect)与顺铂化敏感性显著负相关(P<0.05),见图3d,但是与5-氟尿嘧啶和紫杉醇无显著相关(P>0.05),见图3e～f。上述结果说明,UBE2B在食管癌中高表达可能通过影响患者的放化疗效果而导致不良预后。

2.4 UBE2B与食管癌肿瘤中性粒细胞浸润相关性分析 HPA数据库中HPA数据集和Monaco数据集显示,UBE2B在中性粒细胞中表达最高,具有相对特异性(见图4a～b)。TIMER工具也显示UBE2B与TCGA食管癌样本的中性粒细胞免疫浸润正相关(P<0.05),见图4c,而且UBE2B的表达量与中性粒细胞的经典标志物CD66B(CEACAM8)以及CD11B(ITGAM)正相关(P<0.05),见图4d～e。

图4 UBE2B表达量与食管癌中性粒细胞浸润相关性分析

2.5 UBE2B与食管癌肿瘤T淋巴细胞浸润相关性分析 T细胞免疫干预是目前常用的免疫治疗手段。本研究发现,UBE2B高表达与食管癌患者的CD8阳性T细胞显著正相关(P<0.05),见图5a,而与CD4阳性T细胞无显著相关(P>0.05),见图5b。此外,UBE2B 与肿瘤免疫治疗靶点PD-1(PDCD1)、PD-L1(CD274)、CTLA4正相关,其中PD-L1(CD274)、CTLA4具有显著性差异(P<0.05),见图5c～e。上述结果说明UBE2B与食管癌免疫浸润相关,并且有可能作为食管癌免疫治疗的潜在靶点。

图5 UBE2B表达量与食管癌T淋巴细胞浸润相关性分析

2.6 抑制UBE2B的化合物及药物预测 为了提供通过干预UBE2B表达及活性来治疗食管癌的线索,我们通过CTD base预测靶向于UBE2B的药物。共筛选出23种化合物或药物能降低UBE2B表达及活性(见图6),这些化合物或者药物可以作为后续干预UBE2B治疗食管癌提供线索。此外,预测结果包括常用化疗药物顺铂(cisplatin),这也从侧面验证了2.3结果中高表达UBE2B与食管癌患者的放化疗反应相关。

图6 抑制UBE2B的化合物及药物预测

3 讨论

食管癌作为当今最常见的肿瘤之一,对它的治疗已经从传统的手术、放疗、化疗扩展到结合肿瘤免疫手段进行治疗。以PD-1/PD-L1为靶点的免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade, ICB)治疗可抑制负性调控信号,使T细胞从衰竭状态中释放出来,降低肿瘤免疫逃逸的可能性,逆转免疫抑制微环境,从而显著改善预后[10]。通过寻找耐药或者免疫相关基因,可以为肿瘤的治疗提供治疗靶点。本文综合利用表达分析、相关性分析、预后分析等生物信息学手段,首次证明了UBE2B在食管癌中高表达并且与患者的预后、放化疗反应、肿瘤免疫浸润显著相关。

本研究通过权威数据库TCGA分析发现UBE2B在食管癌中的高表达,而且高表达UBE2B与患者的多种临床参数显著相关,比如人种、分期、淋巴结转移等,这意味着UBE2B一方面有可能在不同特征的食管癌中作用不同,一方面UBE2B的表达量有可能成为诊断不同临床特征的食管癌亚型的标志物之一。高表达UBE2B与低总生存率显著相关,这意味着UBE2B可能是食管癌的发病进程的促进因子,而且有可能作为食管癌预后的标志物。

肿瘤对治疗的反应是影响患者预后的重要因素。食管癌的标准治疗仅限于手术或内窥镜切除和化学放射治疗[11]。大约一半的食管癌患者有远处转移,这些患者主要通过化疗方案进行治疗,如5-氟尿嘧啶、顺铂和他汀类药物的组合[12]。然而,由于食管癌的异质性,它本身就对化疗有抵抗力。本研究发现UBE2B的表达量能够被放疗影响,而且可作为判断放疗、化疗反应性的有效标志物。而且本研究也进一步在食管癌细胞系中发现UBE2B的基因效应与顺铂的敏感性成正相关。这就意味着我们也许可以通过干预UBE2B的表达实现改善食管癌患者放疗、化疗的效果,本研究最后也通过CTD base预测了能干预UBE2B的化合物和药物,为下一步研究提供线索。后续研究需要运用分子生物学实验技术验证UBE2B对食管癌放化疗的作用,比如细胞系中敲低或过表达UBE2B后观察细胞对放化疗的反应,同时需要进一步通过动物实验、临床试验进一步验证。UBE2B与紫杉醇、5-氟尿嘧啶的敏感性虽然也是负相关,但是无显著性,这有可能是因为数据量不足引起,后续研究可以通过体外实验,增加样本量以确认UBE2B对紫杉醇、5-氟尿嘧啶的影响。

近年来,食管癌免疫疗法一直在进行临床前或临床研究,包括肿瘤疫苗接种、免疫检查点抑制和采用T细胞疗法等[13],越来越多的研究表明,免疫治疗与化疗相结合抑制剂比单独免疫治疗或者单独化疗更有效[14]。本研究发现UBE2B与食管癌CD8阳性淋巴细胞浸润相关,而且与PD-L1(CD274)、CTLA4相关。这意味着UBE2B与食管癌CD8阳性淋巴细胞免疫调节相关,而且有可能作为免疫治疗的潜在靶点。此外,本研究发现,UBE2B在中性粒细胞中特异性表达,而且与食管癌中性粒细胞浸润正相关。已经有研究表明食管癌患者围手术期中性粒细胞的浸润与患者的不良预后相关[15],而且食管鳞状细胞癌周围的中性粒细胞聚集与区域淋巴结转移密切相关[16],因此UBE2B的高表达可能通过影响中性粒细胞的食管癌浸润而影响疾病的发展及患者的预后。

综上所述,本研究证明了UBE2B在食管癌中高表达,并且与患者的临床参数、预后、放化疗反应、免疫浸润密切相关,为食管癌的病理基础、诊断、化疗以及免疫治疗提供了参考。