METTL16在多发性骨髓瘤患者中的临床应用价值

汪万杰,许 晗,许婷婷,鲍 静,夏瑞祥

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是目前第二大常见的血液系统恶性肿瘤,近年来发病率逐渐增加。其以骨髓中单克隆性浆细胞异常的恶性增殖为特点,常见的临床症状表现为骨破坏、贫血、高钙血症及肾功能损害等。近年来,随着治疗方案的更新换代以及干细胞移植等技术的应用,MM的预后有了很大改善。但由于其发病机制至今仍未完全明确,治疗药物的耐药和副作用、治疗后复发等都提示着需要探索MM新的治疗策略。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)在真核生物中是一种可逆的、动态的表观遗传修饰,其中甲基转移酶样蛋白16(methyltransferase like protein 16,METTL16)是人类细胞RNA修饰领域的新兴参与者,现在已被证明可以结合MAT2A信使RNA (mRNA)和U6小核RNA (snRNA)并使其甲基化[1]。目前已发现METTL16与肝癌等恶性肿瘤有关[2],但其与MM的相关性还有待发掘。因此,该研究将进一步探寻m6A与MM的诊断及预后的相关性,探讨METTL16在临床诊治中的意义,并初步探索其影响MM可能相关的信号通路。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集2023年4-8月于安徽医科大学第一附属医院血液内科就诊的MM初次就诊患者26例以及标准方案治疗后患者19例、健康人23例,收集患者的骨髓样本及正常人的外周血样本用于分离获得淋巴细胞,所有患者均符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2022年修订)》诊断标准,采用ISS分期。参与本研究者均已签署书面知情同意书。本研究方案遵循赫尔辛基宣言的原则,已获得安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准(No.20200040)。

1.2 试剂与仪器人骨髓单个核细胞分离液试剂盒及人全血单个核细胞分离购于北京索莱宝科技有限公司,TRIzol及RPMI1640培养基购自美国Thermofisher公司,引物由上海生工生物工程有限公司设计合成(表1),去基因组与逆转录一管化三代预混液及高特异化学染料法定量PCR预混液(无ROX)由莫纳生物科技有限公司提供。离心机:美国BECKMAN COULTER公司,型号为Allegra X-15R Centrifuge;qRT-PCR仪:美国Bio-Rad公司,型号为CFX Connect。

表1 引物序列

1.3 相关性分析下载多发性骨髓瘤研究基金会(The Multiple Myeloma Research Foundation,MMRF)数据库及基因型-组织表达项目(The Genotype-Tissue Expression,GTEx)数据库中多发性骨髓瘤患者及正常人组织中m6A相关基因的表达数据集,检验MM患者与正常对照各m6A相关基因的表达差异,分析其与患者生存预后的相关性。

1.4 标本的采集与检测采用 Ficoll 分离方法分离骨髓及外周血中的单个核细胞,将细胞于RPMI1640培养基中混悬,于含5%CO2、37 ℃培养箱中静置24 h。吸取静置后的细胞悬液于离心机中4 ℃、1 000 r/min离心5 min,弃上清液,获得骨髓及外周血淋巴细胞。加入TRIzol试剂提取淋巴细胞RNA,使用去基因组与逆转录一管化三代预混液逆转录合成cDNA,高特异化学染料法定量PCR预混液(无ROX)进行qRT-PCR。所有操作严格按照说明书执行。收集初诊及复查患者相关的临床指标(表2),包括性别、年龄、血红蛋白(hemoglobin, Hb)、白细胞数(white blood cell count, WBC)、血小板数(blood platelet count, PLT)、血肌酐(serum creatinine, Scr)、血清钙离子(serum calcium, Ca2+)、β-微球蛋白(β-microglobulin, β-MG)、骨破坏、ISS分期、分型等。其中Hb、WBC、PLT由临检室提供,Scr、Ca2+、β-MG由生化室提供,骨破坏由影像学检查判断。

2 结果

2.1 MM患者与正常组织m6A各相关酶表达水平及生存分析通过分析MMRF及GTEx数据库中MM患者及正常组织对照的基因表达量及临床信息发现,METTTL3、METTL16、WTAP、RBM15、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1及YTHDC2在MM患者中表达量均显著高于正常组织,而METTL14和FTO则相反,差异有统计学意义(图1)。预后分析显示METTTL3、METTL14、METTL16、RBM15、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2及YTHDC2基因均与更短的生存期相关(图2)。

图1 MMRF及GTEx数据库中m6A相关基因的表达水平

图2 MMRF数据库中m6A相关基因生存曲线

2.2 m6A各相关酶在MM患者及正常对照中的表达情况收集初诊MM患者、标准方案治疗后MM患者的骨髓标本及正常人外周血样本,提取其中的淋巴细胞进行qRT-PCR,其结果(图3)提示METTL16、WTAP、RBM15、ALKBH5、YTHDC1、YTHDC2及YTHDF2在初诊和复查的MM患者中表达均显著高于正常对照,同时初诊MM患者中的表达量也高于治疗后复查的患者(P<0.05),而METTL3与FTO、YTHDF1在初诊患者中的表达量也显著高于治疗后患者,METTL14及YTHDF2在初诊患者中的表达量则显著高于正常对照,差异均有统计学意义。计算初诊患者中各基因表达量相对于正常对照中的倍数,观察其中表达升高更加显著的基因(图4)。

图3 MM初诊患者、治疗后复查患者及正常对照m6A表达水平

图4 初诊患者中m6A各基因相对于正常对照表达量升高倍数

2.3 METTL16与初诊患者各临床指标的相关性收集初诊患者各临床指标,与METTL16表达量进行临床相关性分析(图5)。根据分析结果可以发现,Hb、WBC、β-MG、生存期、分期及骨破坏等均与METTL16有显著相关性(P<0.05)。其中Hb及生存期与METTL16的表达呈负相关性,WBC、β-MG及分期均与METTL16表达呈正相关性,而当患者出现骨破坏后,骨破坏的程度也与其表达量呈正相关。

图5 初诊MM患者METTL16表达与临床各指标相关性分析

2.4 METTL16与炎症因子和趋化因子表达的相关性在初诊患者样本中使用qRT-PCR检测炎症因子IL-4、IL-6、IL-10、IL-18以及趋化因子CCL2、CCL3、CCL4的表达量。分析METTL16与炎症因子及趋化因子表达的相关性(图6),可以发现METTL16与CCL4的表达呈正相关(P<0.05)。

图6 初诊MM患者METTL16表达量与CCL4表达量相关性分析

3 讨论

近年来,对于m6A各基因在多种肿瘤中发挥的调控作用研究非常多,其中包括肝癌、肺癌以及急性髓系白血病[3]等,其主要通过参与mRNA的翻译、降解和剪切等来改变靶基因的表达。而在MM中,METTL3目前已被发现可以影响MM细胞的干性,抑制其凋亡[4],同时,FTO和ALKBH5均可以在YTHDF2依赖的情况下促进MM细胞的增殖和侵袭,抑制其凋亡[5-6]。HNRNPA2B1则可以通过介导多条通路,包括AKT3、TLR4等基因的表达与修饰,促进MM细胞的增殖和侵袭[7-8]。

本研究选取m6A中较为常见的11个相关基因,包括METTL3、METTL14、METTL16、WTAP、RBM15、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1和YTHDC2,在MMRF及GTEx数据库中对其表达量与MM的发病及预后进行相关分析,其结果显示除METTL14和FTO外,其余基因在MM患者中表达量均显著高于正常组织,其中METTTL3、METTL1、RBM1、ALKBH、YTHDF1、YTHDF2及YTHDC2基因的表达与生存时间呈负相关,均提示更差的预后。在临床样本中进一步验证此结果,可以发现在MM患者中METTL16、WTAP、RBM15、ALKBH5、YTHDC1、YTHDC2及YTHDF2的表达均显著高于正常对照,同时经标准方案治疗后上述基因的表达量也同样均低于初诊患者。而初诊患者与正常对照相比的表达倍数显示,METTL16、WTAP、ALKBH5、YTHDF2、YTHDC1及YTHDC2的表达倍数显著较高。在上述基因中,METTL16与MM的相关性是显著的,但目前对于METTL16调控MM疾病发生与进展的影响与机制尚不明确,因此本研究选取METTL16进一步探究其在MM疾病中的临床应用价值。

对METTL16的基因表达量与初诊MM患者的临床指标进行相关性分析,显示其与多个指标具有相关性,其中包括与Hb、生存期的负相关以及与WBC、β-MG、分期及骨破坏等的正相关。MM的主要症状包括贫血、骨破坏、高钙血症及肾功能损害,而METTL16与Hb的负相关以及骨破坏的正相关提示其表达量越高,患者的贫血程度越重,而当患者出现骨质破坏后,METTL16的表达越高则预示着更严重的骨破坏。这些都提示METTL16与MM疾病的进展相关。而既往的研究显示,β-MG与MM的更差分期及预后相关[9],因此METTL16与β-MG以及分期的正相关提示其表达越高,预示着疾病的更差分期及预后。根据以上结果可以发现,METTL16的表达往往提示临床MM患者的疾病进展,预示着更差的分期和预后,对于临床的诊治具有指导意义。

炎症因子是指参与各种炎症反应的细胞因子。在既往多年对于肿瘤相关的研究中已经发现,促进肿瘤的炎症也是癌症的特征之一。肿瘤微环境中的炎症失调直接通过细胞因子诱导的恶性细胞刺激和(或)间接通过诱导生长因子、血管生成和组织重塑促进肿瘤生长。同样的, IL-1β、IL-6、IL-18等多种炎症因子也均已被证实与MM的发展与预后相关[10-12],参与到MM细胞的增殖、侵袭以及耐药等过程。趋化因子则是炎症反应中使免疫细胞定向趋化的细胞因子蛋白。其主要作用是诱导细胞的定向迁移,在炎症及体内各平衡过程中管理白细胞向各位置的定向归巢,其分泌通常由炎症因子刺激,并与炎症因子协同作用。趋化因子在MM的发展过程中也发挥着重要作用,包括趋化因子配体(chemokine ligand,CCL)3、趋化因子受体(chemokine receptor,CCR)1等多种趋化因子均被证明调控MM的进展和耐药[13-14]等多种生物学过程。因此,本研究选取4种炎症因子和3种趋化因子,探究METTL16的表达与其是否具有相关性,能否进一步研究METTL16调控MM可能的相关通路。

METTL16与炎症因子及趋化因子的相关性分析表明其与CCL4的表达具有显著的正相关性,METTL16表达越高,CCL4的表达也越高。该结果提示METTL16可能通过CCL4相关的信号通路调控MM的进展及预后。CCL4,一种CC趋化因子,也被称为巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein , MIP)-1β,可以对各种类型的免疫和非免疫细胞具有多种作用。目前已知CCL4可以通过募集调节性T细胞和致瘤性巨噬细胞,并作用于肿瘤微环境中的其他驻留细胞,如成纤维细胞和内皮细胞,促进其致瘤能力,从而促进肿瘤的发生和进展[15]。但对于CCL4与MM的作用目前尚不清楚。因此,在进一步的研究中可以探究CCL4与MM的相关性,并明确METTL16是否通过CCL4相关的信号通路调控MM的疾病发生和发展。

综上所述,MM患者的骨髓中m6A多种基因均呈高表达,其中METTL16的高表达对于评估疾病的进展以及预测预后具有重要的临床价值。同时,METTL16与趋化因子CCL4的表达呈正相关,在未来的研究中可以进一步明确其与MM相关的信号通路,寻找能够抑制METTL16表达的治疗方式,为MM寻找新的治疗策略。