荆芥和砂仁挥发油对米象熏蒸活性的协同作用及成分研究

杨悦玲, 苏懿清, 何洋洋, 梁宗锁, 王 芳, 梁 倩,

(西南林业大学林学院1,昆明 650224)

(浙江理工大学绍兴生物医药研究院2,绍兴 312000)

仓储害虫对粮食储藏造成巨大威胁,据估计非洲国家储存环节粮食损失率为10%～30%[1]。米象(SitophilusoryzaeLinnaeus)是重要的储粮害虫[2],对多种谷物及其加工品、豆类、油料、干果、药材均可造成严重危害[3]。小麦感染米象后,随着时间的推移,小麦表面覆粉明显,千粒重下降,水分含量升高,面筋吸水量降低,品质变劣[4]。长期以来使用磷化氢作为熏蒸剂防治仓储害虫,但是多次反复使用存在影响公众健康、环境安全及产生害虫抗性等潜在问题[5,6]。植物挥发油是由不同生物活性化合物构成的小分子脂溶性物质,主要成分有单萜、倍半萜及其含氧衍生物[7],穿透能力强,可以破坏昆虫的体壁结构,溶解蜡质层,增强了穿透、吸收、转运和进入气孔等的能力,提高了杀虫效果[8]。植物挥发油有易降解,不伤害害虫天敌等非靶标生物,对害虫的作用方式多样,害虫不易产生抗药性等优点,发展潜力巨大。

荆芥(NepetacatariaL.)为唇形科(Lamiaceae)荆芥属(Nepeta)多年生植物[9]。荆芥挥发油具有良好的杀虫活性,对灰翅夜蛾具有良好的熏蒸与触杀活性[10],对埃及伊蚊、斯氏按蚊和致倦库蚊有驱避活性[11]、对西花蓟马具有良好的产卵抑制活性及急性毒性活性[12]。砂仁(AmomumvillosumLour.)为姜科(Zingiberaceae)豆蔻属(Amomum)植物[13]。砂仁挥发油对绿豆象熏蒸后的产卵量、孵化率、羽化率、雌性比率、发育历期等均有明显的抑制作用[14],对赤拟谷盗和烟草甲均具有不同程度的触杀和驱避活性,砂仁挥发油在较高浓度时对赤拟谷盗和烟草甲具有驱避活性,随着浓度的降低,表现出不同程度的引诱活性[15]。

植物挥发油及其主要成分的混配或作为杀虫剂的增效剂可以提高杀虫活性,这种协同效应可以减少杀虫剂的用量,减少对环境的危害,也可延缓害虫抗性的发生。Tak等[16]研究结果表明,柠檬草挥发油的主要成分柠檬醛与香叶醇乙酸酯按照质量比1∶1混配,对粉纹夜蛾三龄幼虫的杀虫活性最好,协同比为1.92。郝蕙玲等[17]研究结果表明,松油烯- 4-醇、桉叶油醇与松油烯-4-醇复配对醚菊酯具有协同作用。

研究基于前期对20种植物挥发油的筛选,发现荆芥挥发油对米象的熏蒸活性最好。以各挥发油的LC30为基础进行混配,发现荆芥挥发油与砂仁挥发油混配后具有良好的协同作用。通过气相-质谱法和化合物消除法评价了荆芥挥发油和砂仁挥发油的化学成分及确定了主要活性成分,并且通过活性化合物的混配确定其协同作用,以期为荆芥和砂仁2种植物资源的开发利用及米象的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20种植物样品经西南林业大学林学院植物学教研室戚建华副教授鉴定,样品的种名、拉丁名、科名、采集地、采集部位见表1。

表1 植物样品的种名、拉丁名、科名、采集地及采集部位

D-柠檬烯(纯度≥99%)、异薄荷酮(纯度≥98%)、胡薄荷酮(纯度≥95%)、芳樟醇(纯度≥98%)、冰片(纯度≥96%)、(-)-4-萜品醇(纯度≥98%)、石竹烯氧化物(纯度≥90%)、β-蒎烯(纯度≥95%)、桉叶脑(纯度≥99%)、樟脑(纯度≥96%)、左旋松油醇(纯度≥98%)。正己烷为分析纯。

1.2 仪器与设备

HP7 890A-5 975C气相色谱-质谱联用仪等。

1.3 方法

1.3.1 挥发油的提取

20种植物挥发油的提取参照中国药典附录XD中的甲法。3 L的圆底烧瓶中加入提取样品,加入适量的水,置电热套中,连接挥发油提取器及回流冷凝管,加热提取5～6 h,至油量不再增加时停止加热,得到油状物,冷冻干燥,冷藏备用。

1.3.2 挥发油成分的测定

气相色谱条件: HP7 890A-5 975C气相色谱-质谱联用仪。色谱柱:毛细管柱(30 m×0.25 mm 0.25 μm)。升温程序:100 ℃保持2 min,以4 ℃/min升至250 ℃,保持10 min。载气(He)流速为1.2mL/min,进样量0.2 μL,分流比100∶1。质谱条件:离子源EI,电子能量70 eV,气质接口温度280 ℃,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃。电子倍增器电压为1 894 V。采用wiley7 n.l标准谱库检索定性。通过面积归一化法计算各化合物的相对含量。

1.3.3 米象的培养条件

供试米象虫源由西南林业大学生物多样性保护与利用学院昆虫学实验室提供。培养温度:26～28 ℃,相对湿度:65%～75%,光照周期为光照∶黑暗=16 h∶8 h,用大米饲养,7 d 后筛去成虫,待新一代成虫羽化大量出现1～2周,筛出成虫作为试虫[18]。

1.3.4 熏蒸活性测定方法

参照Arabi等[19]和Ncibi等[20]的熏蒸方法,测定挥发油对米象的熏蒸活性。通过预实验确定测试浓度,正己烷做溶剂。取带盖玻璃瓶(直径2.5 cm,高度6.0 cm),放入10只试虫,将直径2.0 cm的滤纸用固体胶粘在瓶盖里面,吸取不同浓度的挥发油溶液10 μL滴在滤纸上,挥发20 s后,拧紧瓶盖,每组10只,重复5次,放在培养箱培养。用正己烷做对照。24 h时检查试虫的存活情况,记录数据,用式(1)和式(2)计算死亡率和校正死亡率。用SPSS软件,分析-回归-概率计算致死中浓度LC50(mg/L)。

(1)

(2)

式中:Na为死亡虫数;Nb为处理总虫数;Nc为处理组死亡率;Nd为对照组死亡率。

1.3.5 荆芥挥发油与其他19种挥发油的混配

参照Abbassy等[21]和Dhinakaran等[22]的混配方法,测定荆芥挥发油与其他19种植物挥发油的协同作用。按照各自挥发油的LC30配制一系列挥发油,测试每种挥发油对米象熏蒸活性的校正死亡率及各混剂的校正死亡率,通过式(3)计算共毒性因子(CTF)。

共毒性因子=

(3)

混剂预期校正死亡率为每种挥发油实际的校正死亡率相加,当CTF≥20为协同作用,-20

1.3.6 化合物消除法评价荆芥与砂仁挥发油主要化合物对米象熏蒸活性的贡献

参照Kim等[23]和Yeom等[24]的方法,评价荆芥和砂仁挥发油主要成分对米象熏蒸活性的贡献。对荆芥挥发油和砂仁挥发油中成分质量分数大于3%的化合物按照其自然比例进行混配。配制荆芥挥发油一系列溶液:LC90质量浓度(26.51 mg/L)的荆芥挥发油溶液、荆芥混配油(D-柠檬烯、异薄荷酮和胡薄荷酮,混配质量比例为5.39∶18.37∶61.13)、混配油-D-柠檬烯溶液(混配油消除D-柠檬烯)、混配油-异薄荷酮溶液、混配油-胡薄荷酮溶液。配制砂仁挥发油一系列溶液:LC90质量浓度(141.92 mg/L)的砂仁挥发油溶液、砂仁混配油(β-蒎烯、桉树脑、芳樟醇、樟脑、冰片、(-)-4-萜品醇、左旋松油醇和石竹烯氧化物按照质量比6.73∶12.56∶3.44∶4.11∶6.20∶6.23∶10.52∶8.04混配)、混配油-β-蒎烯、混配油-桉树脑、混配油-芳樟醇、混配油-樟脑、混配油-冰片、混配油-(-)-4-萜品醇、混配油-左旋松油醇及混配油-石竹烯氧化物。每组挥发油测试10只试虫,重复5次。

1.3.7 胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇混配对米象的熏蒸活性

参照Kim等[23]和Chen等[25]的测定方法,测试胡薄荷酮与(-)-4-萜品醇之间的相互作用。胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇按照61.13∶6.23比例及1∶1的质量比进行混配。通过式(4)和式(5)计算预期的LC50和协同比。

(4)

(5)

式中:w1为化合物E在混剂中的比例;w2为化合物F在混剂中的比例;w3为化合物G在混剂中的比例;LC50(E)为化合物E的实际LC50;LC50(F)为化合物F的实际LC50;LC50(G)为化合物G的实际LC50;R为协同比,R>1.5为协同作用,0.5

2 结果与分析

2.1 20种挥发油对米象的熏蒸活性

20种植物挥发油对米象的熏蒸活性见表2。荆芥挥发油对米象的熏蒸活性最好。茴香、灰毛莸、肉桂、肉豆蔻对米象也具有较好的熏蒸活性,LC50均小于20.00 mg/L。艾、薄荷、细辛、迷迭香、石香薷、砂仁对米象熏蒸活性的LC50均小于50.00 mg/L。白豆蔻、望春玉兰、八角、姜、香附子、酸橙、丁香蒲桃、清香木和木姜子的熏蒸活性较弱。

表2 20种植物挥发油对米象的熏蒸活性

2.2 荆芥挥发油与其他19种挥发油混配对米象的熏蒸活性

荆芥挥发油与其他19种挥发油混配对米象的熏蒸活性见表3。荆芥挥发油与肉豆蔻、迷迭香、石香薷、砂仁、望春玉兰、姜、清香木挥发油混配都具有协同作用,与砂仁挥发油混配的协同作用最好。荆芥挥发油与茴香、灰毛莸、肉桂、细辛、白豆蔻、酸橙、丁香蒲桃和木姜子挥发油混配,具有相加作用。荆芥挥发油与艾、薄荷、八角和香附子挥发油混配具有拮抗作用。

表3 20种植物挥发油二元混配对米象的熏蒸活性

2.3 荆芥和砂仁挥发油的化学成分

荆芥和砂仁挥发油的化学成分分别见表4和表5。由表4可以看出,荆芥挥发油中质量分数大于3.00%的主要成分为D-柠檬烯、异薄荷酮和胡薄荷酮,质量分数分别为5.39%、18.37%和61.13%,3种主要成分的质量分数为84.89%。

表4 荆芥挥发油的化学成分

表5 砂仁挥发油的化学成分

由表5可以看出,大于3%的主要化合物有β-蒎烯、桉树脑、芳樟醇、樟脑、冰片、(-)-4-萜品醇(松油烯-4-醇)、左旋松油醇和石竹烯氧化物共8种化合物,总质量分数为57.83%。

2.4 荆芥与砂仁挥发油主要化合物对米象熏蒸活性的贡献

荆芥挥发油以LC90浓度对米象熏蒸活性的校正死亡率为96.00%,混配油、混配油-D柠檬烯、混配油-异薄荷酮、混配油-胡薄荷酮的校正死亡率分别为98.00%、92.00%、94.00%、0.00%。混配油-胡薄荷酮的校正死亡率与荆芥挥发油、混配油、混配油-D柠檬烯、混配油-异薄荷酮的校正死亡率存在显著差异,因此,认为胡薄荷酮是荆芥挥发油的主要活性成分。

砂仁挥发油、混配油、混配油-β-蒎烯、混配油-桉树脑、混配油-芳樟醇、混配油-樟脑、混配油-冰片、混配油-(-)-4-萜品醇、混配油-左旋松油醇、混配油-石竹烯氧化物的校正死亡率分别为90.00%、94.00%、98.00%、96.00%、100.00%、94.00%、96.00%、70.00%、98.00%和100.00%。混配油-(-)-4-萜品醇与砂仁挥发油、混配油及消除其他7种化合物的校正死亡率存在显著性差异。因此,认为(-)-4-萜品醇是砂仁对米象熏蒸活性的主要活性化合物。

2.5 胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇对米象的熏蒸活性

胡薄荷酮与(-)-4-萜品醇对米象的熏蒸活性见表6。通过化合物消除法得到的胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇活性化合物的LC50对米象的熏蒸活性明显好于20种挥发油对米象的熏蒸活性。因此化合物消除法可以用于挥发油活性成分的筛选。

表6 胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇对米象的熏蒸活性

2.6 胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇混配对米象的熏蒸活性

胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇混配对米象的熏蒸活性见表7。胡薄荷酮与(-)-4-萜品醇按照61.13∶6.23的比例混配的协同比要优于1∶1的比例混配的协同比,按照0.5

表7 胡薄荷酮与4-萜品醇混配对米象的熏蒸活性

3 讨论

对20种不同植物挥发油进行米象熏蒸活性筛选,发现荆芥挥发油明显优于其他19种挥发油,LC50为13.27mg/L(14.27 μL/L)。荆芥挥发油的活性成分胡薄荷酮及砂仁挥发油的活性成分(-)-4-萜品醇对米象熏蒸活性LC50分别为7.34(7.57 μL/L)和8.35 mg/L(8.98 μL/L)。Lee等[26]研究结果表明18种植物挥发油中,桉树挥发油对米象的熏蒸活性最好,1,8-桉叶素是桉树的主要成分,也是熏蒸活性最好的化合物,LC50分别为28.9、23.5 μL/L。Moses等[27]研究结果表明八角黄皮挥发油对米象熏蒸活性LC50为17.84 μL/L。Wang等[28]研究结果表明大丽花挥发油及主要成分D-柠檬烯、4-松油醇和α-松油醇对米象熏蒸活性的LC50分别为14.10、7.92、12.03、38.22 mg/L。Kim等[29]研究结果表明香菜、莳萝和孜然挥发油对米象熏蒸活性的LC50分别为2.45、3.29、4.75 mg/L。从熏蒸活性可以看出,荆芥挥发油和其他挥发油相比,对米象的熏蒸活性优于大多数挥发油,但是不及香菜、莳萝和孜然挥发油对米象的熏蒸活性。从化学成分来看,胡薄荷酮的熏蒸活性要优于其他提到的化合物对米象的熏蒸活性。

为了评价荆芥挥发油中3种主要成分D-柠檬烯、异薄荷酮和胡薄荷酮及砂仁中8种主要成分β-蒎烯、桉树脑、芳樟醇、樟脑、冰片、(-)-4-萜品醇、左旋松油醇和石竹烯氧化物对米象熏蒸活性的贡献,用化合物消除法确定胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇为荆芥和砂仁挥发油熏蒸活性的主要成分。文献报道罗勒挥发油的4种主要成分为草蒿脑、芳樟醇、α-蛇麻烯和十一酸甲酯[23],消除草蒿脑和芳樟醇时,对斜纹夜蛾三龄幼虫的校正死亡率与罗勒挥发油、混配油、α-蛇麻烯和十一酸甲酯存在显著性差异,说明草蒿脑和芳樟醇是罗勒挥发油对斜纹夜蛾三龄幼虫杀虫活性成分。橘子挥发油的6种主要成分为柠檬烯、β-蒎烯、γ-松烯、十一酸甲酯、α-蒎烯和邻伞花烃。消除柠檬烯时,对斜纹夜蛾三龄幼虫的校正死亡率与橘子挥发油、混配油及消除其他5种化合物存在显著性差异,说明柠檬烯是橘子挥发油对细纹夜蛾三龄幼虫杀虫活性成分。芡欧鼠尾草挥发油的主要成分有14种,仅消除α-侧柏酮时对甜菜夜蛾三龄幼虫的校正死亡率与挥发油、混配油及其他13种主要成分存在显著性差异[25]。说明α-侧柏酮是芡欧鼠尾草挥发油对甜菜夜蛾三龄幼虫杀虫活性的主要成分。可以看出化合物消除法用于筛选活性化合物是行之有效的方法。

胡薄荷酮为荆芥挥发油对米象熏蒸活性的主要成分,此外胡薄荷酮还对其他害虫具有杀虫活性。长叶薄荷挥发油的主要成分胡薄荷酮对尖音库蚊熏蒸活性的LC50为578.48 μL/L[30]。轮叶金鸡菊挥发油的主要成分胡薄荷酮对玉米象的熏蒸活性LC50为11.81 μL/L[31]。(-)-4-萜品醇为砂仁挥发油对米象熏蒸活性的主要成分,此外(-)-4-萜品醇还具有其他杀虫活性。如冷蒿挥发油的主要成分(-)-4-萜品醇对嗜卷书虱和赤拟谷盗具有良好的熏蒸活性,LC50分别为0.08、3.74 mg/L,对嗜卷书虱和烟草甲具有触杀活性,LD50分别为33.10 μg/cm2、8.62 μg/头[32]。

为了解胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇之间相互作用对米象熏蒸活性的整体贡献,胡薄荷酮与(-)-4-萜品醇分别按照挥发油自然质量比例及1∶1的比例混配后具有相加作用。混剂熏蒸活性优于每种挥发油的熏蒸活性,按照各自挥发油自然比例混配后的熏蒸活性优于各自化合物的熏蒸活性。Kim等[23]研究了28种挥发油对斜纹夜蛾三龄幼虫杀虫活性的筛选,发现罗勒挥发油的杀虫活性最好,因此用罗勒与其他27种挥发油以各自的LD25混配,罗勒挥发油与橘子挥发油混配协同作用最好。罗勒挥发油的主要活性成分草蒿脑和芳樟醇与橘子挥发油的主要成分柠檬烯按照各自挥发油的比例及1∶1的比例混配,均表现出相加作用。植物挥发油的化学成分复杂多样,杀虫活性取决于所含的化学成分以及化学成分的组成,研究其化合物对害虫的协同作用,在生物防治领域具有重要意义。

4 结论

通过对20种植物挥发油的筛选,发现荆芥挥发油对米象的熏蒸活性最好,LC50为13.27 mg/mL。荆芥挥发油以LC30与其他19种挥发油的LC30混配,砂仁挥发油表现出最大的协同作用,共毒性因子为107.14。气相-色谱法检测荆芥与砂仁挥发油的化学成分,荆芥挥发油的主要成分为D-柠檬烯、异薄荷酮和胡薄荷酮。砂仁挥发油的主要成分为β-蒎烯、桉树脑、芳樟醇、樟脑、冰片、(-)-4-萜品醇、左旋松油醇和石竹烯氧化物。通过化合物消除法评价荆芥挥发油和砂仁挥发油的主要活性成分分别为胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇,对米象熏蒸活性的LC50分别为7.34和8.35 mg/L,优于荆芥挥发油的熏蒸活性。胡薄荷酮和(-)-4-萜品醇按照自然比例61.13∶6.13和1∶1的比例混配,LC50值分别为5.91和8.29 mg/L,协同比分别为1.26和0.94,具有相加作用。