囊胚培养与移植在不孕症患者中的应用

张丹丹,童 旭,王洋洋,马陈东,沈 澍

(1.皖北煤电集团总医院生殖医学科;2.宿州市生殖医学与胚胎重点实验室,安徽 宿州 234000)

随着辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)发展日趋成熟,IVF/ICSI-ET已成为治疗不孕症患者的常规方法,给一部分不孕不育家庭带来了新希望,但随之也出现了如卵巢过度刺激、多胎妊娠、异位妊娠、胎儿畸形等问题[1-2]。目前,在ART治疗周期中,常采用形态学评分法对胚胎发育潜能进行评估,依据评分级别进行选择移植、培养、冷冻或者丢弃[3-4]。然而,根据形态学评分判断D3胚胎的发育潜能还存在一定局限性,并不具有普遍适用性。因此,为了获得更高的IVF成功率,特别是对于经历了因胚胎质量差而放弃周期的患者,探寻新的技术方法尤为重要。近年来,人们把目光聚焦到ART的另一个关键环节—囊胚培养[5-6]。囊胚培养因其能通过延长胚胎培养时间进一步筛选出发育潜能更高的胚胎,而被广泛应用于临床上。囊胚培养越过了胚胎基因组激活阶段,经历了细胞融合、囊腔形成与扩大,并淘汰了一些发育潜能较差的胚胎[7]。另外,囊胚移植还有利于增加子宫内膜和胚胎发育的同步性,显著提高临床妊娠率和胚胎着床率,降低多胎妊娠率[4,8]。因此,目前众多中心都采取将受精后D3胚胎继续行囊胚培养至D5/D6天冷冻做移植的临床策略。本研究针主要对ART助孕中移植、冷冻后剩余胚胎行囊胚培养与移植的患者分析其妊娠结局,旨在为ART周期中胚胎质量差的患者争取更多的妊娠可能性。

1 资料与方法

1.1 研究对象对2021年11月至2023年4月在本院生殖中心接受IVF/ICSI-ET治疗的631例新鲜周期患者的一般资料和促排卵效果进行分析,并对受精后D3卵裂期胚胎按照患者意愿分配处理:即胚胎移植、冷冻、丢弃或囊胚培养。继续培养至D5/D6观察囊胚形成,对囊胚进行移植、冷冻或丢弃。同时,本时间段内接受冻融周期即D3卵裂期或D5/D6囊胚期移植患者的的妊娠结局进行比较。本研究经本院医学伦理委员会审查通过,所有患者均签署知情同意书。

新鲜周期:纳入标准:(1)常规IVF和ICSI受精的患者;(2)受精后有D3胚胎可移植、冷冻、囊胚培养或丢弃的患者。排除指标:(1)超数排卵但未行阴道B超下取卵术的患者;(2)行阴道B超下取卵但未获取到卵子的患者;(3)一般资料统计不完整的患者。

冻融周期:纳入标准:(1)复苏D3卵裂期胚胎移植的患者;(2)复苏D5/D6囊胚移植的患者。排除指标:(1)解冻复苏过程中胚胎崩解或退化的患者;(2)解冻复苏后要求取消移植的患者。

1.2 分组依据新鲜周期:对受精后D3卵裂期胚胎根据是否行囊胚培养及是否形成囊胚分为:未养囊组、养囊成功组和养囊失败组;又根据移植胚胎的时期分为:卵裂期移植组和囊胚移植组。冻融周期:冷冻复苏D3卵裂期胚胎培养17 h后移植,根据移植前胚胎时期分为卵裂期移植组 (移植前2枚均为卵裂期)、混合期移植组 (移植前1枚为卵裂期,另1枚为囊胚期)、以及冷冻复苏D5/D6囊胚的囊胚移植组。

1.3 方法

1.3.1 一般资料 对2021年11月至2023年4月在本院生殖中心接受IVF/ICSI-ET治疗的631例新鲜周期患者的一般资料,主要包括女方年龄、女方身体质量指数(ballistic missile intercept,BMI)、不孕年限和促排卵效果(如Gn天数、Gn总量、HCG日LH和E2水平)、获卵数、受精卵数、胚胎发育情况以及移植胚胎类型与临床妊娠结局进行分析比较。同时,对本时间段内接受冷冻复苏D3卵裂期或D5/D6囊胚期移植助孕患者的妊娠结局进行比较。

1.3.2 促排卵治疗方案及授精 所有患者均采用本中心常规使用的促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone antagonis,GnRH-a,达必佳,德国)和重组卵泡刺激素(FSH,果纳芬,默克雪兰诺,意大利)的标准长或短方案进行控制性促排卵,当阴道B超监测到2个或以上直径≥18 mm卵泡时,肌肉注射10 000 U HCG(丽珠制药,中国珠海),36 h后在阴道B超监测下采卵。取卵当日根据男方精液质量选择IVF或ICSI受精方式。授精18～20 h观察原核数目。

1.3.3 胚胎培养与胚胎评估 胚胎培养:在Quinn’s-1026(SAGE,Amercica)培养液中加入10%人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA,SAGE,Amercica)配成卵裂期胚胎培养液,在37 ℃,6% CO2和最合适湿度培养箱中平衡过夜,受精后胚胎在此培养液中培养到D3。

胚胎评估:根据形态学参数对D3胚胎进行质量评估,将早期胚胎分为4级。Ⅰ级:细胞卵裂球均匀,胞质无碎片或少量碎片(<10%)。Ⅱ级:细胞大小略不均匀,胞质少许碎片(10%～20%)。Ⅲ级:细胞大小明显不均匀,胞质明显碎片(21%～50%)。Ⅳ级:细胞大小严重不均匀,胞质严重碎片(>50%以上)。

1.3.4 囊胚培养方式和囊胚分级标准 囊胚培养:移植或/和冷冻后剩余胚胎经患者同意后行囊胚培养,均签署囊胚培养知情同意书,将20% HSA加入Quinn’s-1029(SAGE,Amercica)配成囊胚培养液,放置在相同条件的培养箱中培养至D5/D6天,观察囊胚形成情况。

囊胚发育分级标准:采用Gerdner标准对囊胚进行评估分级[9]。根据囊胚发育、内细胞团发育及滋养层细胞发育情况综合判定囊胚等级。首先根据囊胚腔的大小以及是否孵出,将囊胚划分为1～6期;接着依据细胞数目以排列方式对内细胞团发育进行分级(针对3～6期的囊胚):A级为细胞分裂数目多且排列密集;B级为细胞分裂数目较少且排列较为松散;C级为细胞分裂数目极少;最后依据上皮细胞层细胞数目以及排列方式对滋养层细胞进行分级(针对3～6期的囊胚):A级为较多细胞组成且排列紧密;B级为部分细胞组成但排列较为松散;C级为稀疏细胞组成。在临床上一般仅对3BC以上的囊胚进行冷冻或者移植,但若形成4CC囊胚则根据患者意愿对其进行酌情处理。囊胚形成率=囊胚形成数/继续培养胚胎数。

1.3.5 胚胎及囊胚冷冻、解冻 卵裂期胚胎及囊胚冷冻和解冻均使用Kitazato公司冷冻液和解冻液。囊胚冷冻前对其进行激光打孔皱缩。按照试剂说明书对胚胎进行冷冻及复苏,复苏后对卵裂期胚胎透明带进行削薄,对囊胚进行激光辅助孵化。胚胎移植日前一天解冻再培养17 h;囊胚则在移植日当天提前2～4 h解冻。

1.3.6 临床妊娠与临床妊娠率 移植14 d后检测患者血清中HCG浓度,阳性者4～6周后行B超监测,见孕囊或者心血管搏动,则为临床妊娠。临床妊娠率=临床妊娠数/移植周期数×100%。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计数资料用例数(n)表示;符合正态分布定量资料用“均数±标准差”表示,两组间比较采用独立样本t检验,三组间比较采用单因素方差分析,定性资料比较采用卡方检验和Fisher’s精确检验,以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 未行囊胚培养组与养囊成功组及失败组患者基础一般资料、获卵及胚胎发育情况比较结果显示,631例患者中有1.74%患者未获取到卵子,42.95%患者未行囊胚培养,而21.55%(136/631)患者养囊失败,仅有33.76%(213/631)患者养囊成功。养囊失败组和成功组中共有2213枚胚胎培养形成676枚囊胚,表明囊胚培养可以最大限度提高胚胎利用率,有利于增加患者的移植机率,显著降低患者的经济损失。

对三组患者一般资料统计分析发现,女方年龄、Gn天数、Gn总量及HCG日激素水平均存在显著性差异(表1)。其中养囊成功组患者年龄更小,不孕年限和Gn使用天数更短,Gn用量更少,HCG日LH水平更低,HCG日E2水平更高,提示养囊成功组患者卵巢反应度高,卵巢储备功能好。对获卵及受精后胚胎发育潜能分析发现,三组之间获卵数、卵子成熟度和胚胎发育能力均存在统计学差异(表2)。养囊成功组患者获卵数、成熟卵数、两原核(two pronucleus,2PN)数及2PN卵裂数、可利用胚胎数、优质胚胎数均高于未养囊组和养囊失败组患者。养囊成功组囊胚形成率41.68%(676/1622),而养囊失败组有591枚胚胎培养后未形成囊胚。

表1 三组患者一般资料比较

表2 三组患者胚胎发育能力比较

图1 新鲜周期胚胎培养方式比例

2.2 囊胚培养与移植和卵裂期移植患者资料及胚胎发育能力比较比较IVF/ICSI-ET治疗周期中选择囊胚培养与移植患者和D3卵裂期移植患者的一般资料发现,与D3移植组相比,囊胚移植组患者女方年龄、不孕年限、Gn总量及HCG日LH水平显著降低,HCG日E2水平显著增加(表3),获卵数、成熟卵数、卵裂数及优质胚胎数均显著上升(表4),表明囊胚移植组患者卵巢储备功能好,卵子质量高,胚胎发育潜能强,预示着良好的妊娠结局。

表3 囊胚培养与移植和卵裂期移植患者一般资料比较

表4 囊胚培养与移植和卵裂期移植患者胚胎发育能力比较

2.3 囊胚培养与移植和卵裂期移植患者妊娠结局比较IVF/ICSI-ET治疗周期中D3天选择囊胚培养与移植患者21例,平均移植数1.33(28/21)枚,选择D3卵裂期移植患者293例,平均移植数1.70(500/293)枚。在本生殖中心新鲜周期中卵裂期移植占绝大部分93.31%(293/314)。比较两组妊娠结局发现,囊胚期移植组与卵裂期移植组之间胚胎种植率、临床妊娠率、流产率、多胎妊娠率、异位妊娠率均无显著性差异,但囊胚移植组多胎妊娠率和异位妊娠率更低(表5)。

表5 囊胚培养与移植和卵裂期移患者妊娠结局比较

2.4 冻融周期移植不同时期胚胎妊娠结局比较冻融周期中,D3卵裂期胚胎解冻后培养17 h,观察移植前胚胎增殖情况,仍为卵裂期移植有323例;一枚为卵裂期另一枚为囊胚期移植有33例,复苏D5/D6囊胚移植有177例,比较三组平均移植胚胎数、胚胎种植率、临床妊娠率均存在统计学差异,流产率、多胎妊娠率及异位妊娠率无明显差异(表6)。囊胚移植组平均移植胚胎数更少,胚胎种植率及临床妊娠率更高,流产率和异位妊娠率较低,表明囊胚移植可以提高胚胎植入率,降低不良妊娠结局的发生率。

表6 冻融周期移植三组患者妊娠结局比较

3 讨论

ART治疗周期中,随着促排卵方案不断完善及胚胎实验室培养体系改进,胚胎数量和质量均有了极大的提高[7]。据统计,在IVF-ET助孕周期中仅有30%胚胎得到利用,绝大部分胚胎被废弃,造成严重的胚胎浪费[10]。然而,囊胚培养可以将胚胎进一步培养,延长胚胎发育时间,从而淘汰发育不良的胚胎,筛选出更具有发育潜力的优质胚胎,可间接预测最终妊娠结局[7]。本研究将探讨囊胚培养与移植在不孕症患者治疗中的作用,为提高ART成功率提供一定的理论基础。

本研究对IVF/ICSI-ET治疗过程中根据受精后D3天是否养囊及是否形成囊胚进行分析发现,养囊成功组中女方年龄更年轻、Gn天数和Gn总量更少,而HCG日激素水平更稳定,获卵数、成熟卵数、2PN数、2PN卵裂数、可利用胚胎数和优质胚胎数胚胎均高于未养囊组和养囊失败组,表明养囊成功组的患者卵巢反应度高,卵子质量高,卵巢储备功能较好,与张小霞等研究结果一致[11]。囊胚培养是通过延长培养时间筛选出更具有发育潜能的胚胎。研究证实,取卵后体外培养D3天的低质量胚胎仍具有发育至囊胚的潜能,而对于D3无可用胚胎移植的患者,利用“废弃”胚胎行囊胚“试培养”也不失为一种补救治疗的方法[12-14]。此外,对于高龄低储备不孕患者行全囊胚培养并不会对妊娠结局造成不利影响,相反只要培养成囊胚可供移植,囊胚培养组的妊娠结局优于不养囊胚组[15]。

有研究表明,囊胚培养与移植可以改善子宫内膜和胚胎发育的同步性,增加子宫内膜容受性,同时使发育潜能较好的胚胎实现自我筛选,提高胚胎种植率,从而提高临床妊娠率和活产率[16-17]。相反的是,顾亦凡等研究发现人类发育欠佳胚胎在卵裂期进行移植更加适合[18]。本研究发现,囊胚培养与移植和卵裂期移植相比,胚胎种植率(24.32% vs 29.80%)和临床妊娠率(38.10% vs 43.00%)无统计学差异,这可能是由于本生殖中心新鲜周期以移植D3卵裂期胚胎为主,囊胚移植较少。此外,与罗婷、Muller V等研究一致,囊胚移植异位妊娠率低于卵裂期移植但差异不显著(0% vs 2.38%),可能是移植胚胎天数并不是影响异位妊娠的最主要因素[19-20]。

一项meta分析表明卵裂期胚胎冷冻复苏移植与囊胚期胚胎冷冻复苏移植二者妊娠结局没有差异[21]。而吕金春等认为冻融周期中囊胚移植的临床妊娠结局优于胚胎组,囊胚移植胚胎种植率、妊娠率和多胎妊娠率显著增加[22]。此外,也有其他研究表明,单囊胚移植具有较高的临床妊娠率和着床率,且多胎率降低等优点[19,23]。本研究发现,冻融周期囊胚移植的胚胎种植率和临床妊娠率均显著高于卵裂期移植,但多胎率并没有降低,可能与囊胚移植胚胎数有关。另外,在混合移植组中临床妊娠率也显著增加,流产率和异位妊娠率偏低,表明只要有囊胚形成均能保持较满意的妊娠率[24]。在本生殖中心单囊胚移植策略较少,导致多胎妊娠率偏高,因此在后期要加强单囊胚移植的例数,尽力降低囊胚移植带来的多胎妊娠。

综上所述,囊胚培养与移植囊胚培养是对胚胎的进一步筛选,可以有效提高胚胎利用率,提高胚胎种植率和临床妊娠率,帮助患者获得更好的妊娠结局。但是囊胚培养也有培养失败的风险,一般囊胚形成率为40%～60%,长时间的培养和筛选过程,可能会导致患者无可移植囊胚,给患者造成经济和心理负担。更重要的是体外培养时间延长也可能对印记基因有一定影响,从而影响子代远期安全。因此要充分认识囊胚培养的利弊,有效发挥囊胚培养与移植在临床工作中的作用,选择合理的策略,获得较高的临床妊娠率,减少多胎率和异位妊娠的发生。