白藜芦醇通过AMPK/PPARα/PGC1α影响酒精依赖致肝损伤机制研究

郑天翼,韩智学,薛继婷,徐晓焱,张 杰,刘洪凤,杨 勇,岳 辉

(牡丹江医学院,黑龙江 牡丹江 157011)

酒精依赖综合症具有较高的发病率和死亡率,是全球性的公共卫生问题,除诱发神经系统疾病,常伴有肝病、胰腺炎、乳腺癌、心血管疾病和多种感染等[1]。酒精依赖综合症特征为对酒精的渴望、耐受性、对酒精的专注失去自控能力进而出现酒精戒断综合征[2],酒精依赖患者表现为强烈饮酒冲动;难以控制饮酒行为和酒精停止或减少出现戒断状态等[3]。已知酒精依赖临床治疗有纳曲酮、阿坎酸、纳美芬等抑制神经元活性的药物[4],存在一些副作用。以往研究表明[5-6]针对肝损伤后的治疗,中药相对安全性较高,副作用少。RES广泛存在植物中,是一种天然多酚,可以参与改善氧化应激损伤[7-8];研究发现RES-姜黄素联合使用有显著抑制HepG2细胞脂肪变性作用[9];RES可通过AMPK/SIRT1/Nrf2、ERK/p38、MAPK和PTEN/Akt等信号通路增加抗氧化分子的合成并影响线粒体生物发生的有关基因表达[10]。本研究旨在观察RES对酒精依赖致肝损伤的影响,探究AMPK/PPARα/PGC1α信号通路对酒精依赖大鼠肝损伤的修复机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂及药品RES(批号R8350),吐温-20,甘氨酸,SDS和Tris购自北京Solarbio公司;脱脂奶粉购自美国BIO-RAD公司;PVDF膜(0.45 μm)购自美国Roche公司;预染彩虹蛋白Marker购自美国Thermo公司;5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自上海碧云天公司;PGC1α一抗(兔抗大鼠)购自武汉Proteintech公司;AMPK一抗(兔抗大鼠),p-AMPK一抗(兔抗大鼠),PPARα一抗(兔抗大鼠)和抗体稀释液购自沈阳万类生物公司;GAPDH一抗(兔抗大鼠)和二抗(山羊抗兔/山羊抗小鼠)购自北京Bioss公司;RIPA,PMSF,SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒和超敏ECL化学发光底物购自大连Meilunbio公司;甲醇和异丙醇购自天津富宇精细化工公司。

1.2 实验动物SPF级SD大鼠,雄性,体重180～220 g,6周龄,动物许可证号【SCXK(黑)2019-003】,大鼠饲养于牡丹江医学院实验动物中心SPF级鼠类实验室。本次动物实验经牡丹江医学院伦理委员会审核批准,符合实验动物伦理要求。

1.3 模型制备和样本的采集SPF级的大鼠随机数字表法设置为空白对照(Control)组8只以及模型对照(Model)组32只单笼饲养。适应性饲养1周后通过给与20%酒精的双瓶自由饮制备模型[11-12]。Control组两瓶内均为蒸馏水100 mL;Model组一瓶是20%酒精100 mL,另一瓶是蒸馏水100 mL。饲养24 h后更换瓶内酒精换成蒸馏水,饲养过程中换水时交换水瓶位置避免饲养期间大鼠形成位置偏好。每24 h记录瓶内水和酒精的消耗量,大鼠体重,饲养28 d。当Model组大鼠的酒精摄入量(>3.15 g/(kg·d))和酒精偏好逐渐稳定代表大鼠进入酒精依赖的平台期,即制备SD大鼠酒精依赖模型成功[13-14]。

给与RES药物治疗,将Model组32只大鼠随机分为四组,分别为酒精依赖模型组(alcohol dependence,AD)、RES高治疗组(High)组、RES中剂量治疗(Middle)组和RES低剂量治疗(Low)组。RES按照100、50、25 mg/(kg·d)剂量灌胃给药,Control和AD给与1 mL/(kg·d)生理盐水灌胃,用药两周。治疗结束24 h期间禁食禁水,用异氟烷将大鼠麻醉,处死大鼠取肝组织备用。建模期间记录大鼠体重,双瓶自由饮期间记录瓶内液体量,即饮水量和饮酒量,整理数据计算饮酒偏好(=饮酒量占总液体摄入量的百分比)。

1.4 蛋白免疫印迹法检测大鼠肝组织AMPKα、PPARα和PGC1α蛋白表达水平提取大鼠肝组织,使用RIPA裂解液与PMSF蛋白酶抑制剂混合裂解获得组织匀浆,离心取上清,NanoDrop测量蛋白浓度,按照公式5VSDS-PAGE=VSDS-PAGE+V蛋白+V水;(V蛋白×C蛋白)/(VSDS-PAGE+V蛋白+V水)=40/15加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液和三蒸水于EP管,混匀后沸水煮10 min确保蛋白变性,分装后-20 ℃冷藏。安装好电泳装置每孔15 μL蛋白,电泳电压80 V恒压,30 min后加压至120 V恒压,直至目的蛋白在规定区域内分离显著停止电泳。转膜条件250 mA恒流90 min,转膜后摇床封闭4 h,孵育一抗(一抗浓度1∶1000)4 ℃摇床12 h,1×TBST漂洗5次,每次6 min,孵育二抗(二抗浓度1∶10000)2 h,1×TBST漂洗5次,每次6 min。加入发光显色液通过显影仪拍照并对结果分析。

1.5 统计学方法所有实验数据采用Excel表录入,数据分析采用SPSS 22.0,计量资料采用“均数±标准差”表示,多组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为具有统计学意义的标准进行分析。

2 结果

2.1 双瓶自由饮期间大鼠体重变化实验过程中记录大鼠体重,观察酒精对大鼠生长的影响。直至建模结束时空白对照组大鼠体重与酒精依赖模型组无统计学差异(P>0.05)。见图1。

图1 酒精依赖大鼠体重变化

2.2 20%酒精双瓶自由饮大鼠模型建立结果显示,随着酒精依赖模型建立,用药前酒精摄入量和大鼠的饮酒偏好两指标都在逐步增加,在平台期内趋于稳定,代表模型建立成功。平台期大鼠饮酒组酒精摄入量(9.07±1.12)g/(kg·d)、饮酒偏好(34.95±1.70)%。见表1,图2。

表1 酒精依赖大鼠平台期酒精摄入量和饮酒偏好

图2 酒精依赖大鼠平台期饮酒量和饮酒偏好

2.3 RES对酒精依赖大鼠肝组织AMPK、p-AMPK、PPARα和PGC1α表达的影响酒精依赖模型组肝组织内p-AMPK、PPARα和PGC1α的蛋白相对表达水平相较于空白对照组显著下降(F=8.60,4.38,11.33,P<0.05),RES高剂量组肝组织内的p-AMPK、PPARα和PGC1α蛋白相对表达水平相较于模型组明显升高p-AMPK(F=6.00,High组P<0.05,Middle组P<0.05,Low组P>0.05)、PPARα(F=4.41,High组P<0.05,Middle组P>0.05,Low组P>0.05)和PGC1α(F=5.93,High组P<0.05,Middle组P>0.05,Low组P>0.05),见图3。

3 讨论

目前国内酒精消费量急剧增长,酒精依赖患者显著增加,酒精是诱发慢性肝病的主要驱动因素[15]。长期酒精暴露下,酒精的代谢产物乙醛在肝内积累,乙醛使线粒体功能受损,分解脂肪酸能力下降,造成脂肪在肝细胞内蓄积;另一方面酒精代谢中产生较多活性氧(reactive oxygen species,ROS),过量的氧自由基破坏了肝细胞内的稳态,致使肝脏脂质过氧化[16]。AMPK是细胞能量代谢的重要传感器,AMPK是改善高脂饮食小鼠脂质水平和氧化-抗氧化平衡中的调节靶点[17],对于细胞代谢起到了重要调控作用,通过对关键蛋白的磷酸化,AMPK可以调节不同代谢方向,包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、脂质代谢、糖酵解和线粒体代谢,从而增加脂质的分解代谢过程,减少其合成途径[18]。激活AMPK可能是防止肝脂肪变性进展的一种新保护措施,AMPK信号通路的激活可以改善HepG2细胞的胰岛素抵抗和脂质积累情况[19],研究结果显示,AMPK可以抑制脂肪合成,促进脂肪酸的氧化[20]。以往研究表明[21-22],RES可以通过激活AMPK的表达抑制mTOR信号传导;RES通过AMPK/核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)信号通路减轻了心肌缺血再灌注的氧化应激情况;RES激活AMPK后减少了神经元细胞的凋亡,RES是一种有效的AMPK激活剂,RES可以靶向AMPK抑制因阿霉素诱导的肝脏氧化应激情况并改善肝功能障碍[23-24]。AMPK是PGC-1α的上游调控因子,激活该基因后进一步调控PPARα的表达,具有调控脂肪代谢作用[25]。研究结果[26]显示:异长叶烯在肝缺血再灌注的模型内通过调节AMPK-PGC1α信号通路介导抗炎、抗氧化和抗细胞凋亡作用来减轻肝脏损伤。分子对接结果显示RES通过与Tyr-722形成氢键直接与PGC1α结合,促进其本身核转位[27]。前期研究[28]结果表明,RES改善了酒精依赖大鼠肝组织的氧化应激情况,与模型组比较,RES治疗组抗氧化因子超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)含量升高。

本次实验研究表明RES可介导AMPK/PPARα/PGC1α信号通路影响酒精依赖致肝损伤的修复,此研究为白藜芦醇改善酒精依赖所导致的肝损伤提供了实验依据,拓宽了临床对于酒精依赖患者肝损伤的治疗思路。