QuEChERs方法结合SERS技术检测猪肉中氨基糖苷类抗生素残留

杨海帆

丁 莉2

徐妙文1

沈 康1

王煦博1

(1. 扬州大学医学院,江苏 扬州 225001;2. 扬州大学附属医院,江苏 扬州 225001)

硫酸庆大霉素和硫酸新霉素是众多氨基糖苷类抗生素家族中的一员,具有广谱的抗菌作用[1-2],在畜牧业中常与硫酸结合使用[3-4]。尽管目前养殖业更多使用毒性较小的抗生素,但氨基糖苷类抗生素因低成本和高效的优势仍被广泛应用于禽畜疾病的预防和治疗,然而长期使用可能会导致动物组织中抗生素残留。人类长期摄入抗生素含量超标的食物不仅会诱导细菌产生耐药性[5],甚至会导致过敏反应、耳毒性和肾毒性[6]。GB 31650—2019规定牛、猪肌肉组织中庆大霉素和新霉素的最大残留限量分别为100,500 mg/kg。目前,氨基糖苷类抗生素的检测方法主要有液相色谱法[7]、液相色谱串联质谱法[8]、免疫层析法[1,9]和酶联免疫吸附分析法等[10-12]。色谱法和免疫层析法的灵敏度高,但耗时、成本高,难以实现现场化、快速化和规模化检测;而酶联免疫吸附分析法易发生交叉反应,其假阳性率高。

表面增强拉曼散射(SERS)是一种快速、无损、不受水分干扰的检测方法,结合拉曼光谱与表面材料技术,利用局域表面等离子体共振(LSPR)和化学吸附的方法使得SERS信号显著提升,高灵敏地检测低浓度分析物[13-14]。当检测某些超低浓度的残留物时,纳米材料产生的SERS增强十分关键。金纳米花(AuNFs)具有粗糙的表面和许多分支,在材料表面形成大量的“热点”,为待测分子提供特殊的吸附位点,从而显著增强SERS效应[15]。因此,AuNFs被广泛用作SERS活性基底的制备。PP合成纸是一种典型的疏水材料,可使纳米颗粒在其表面聚集,增强SERS效应。有研究[16]表明,采用还原氧化石墨烯—金复合纳米材料检测氧氟沙星,检测限为0.3 ng/mL。Wattanavichean等[17]以银纳米棒作为基底检测恩诺沙星、土霉素和新霉素,检测限分别为0.5,2.0,100.0 μmol/L,但未应用于食品中抗生素残留的检测。

食品样品成分复杂,传统样品前处理耗时长、精度低,引入误差大[18-19],而样品前处理技术直接关系到整个检测过程的准确性和精密性。QuEChERs方法是目前动物抗生素残留检测领域备受关注的前处理技术[20],具有快速、简单、廉价、有效、可靠、耐用和安全的优点,可极大提高样品前处理效率[21]。目前,QuEChERs方法已成功应用于SERS技术检测食品中抗生素残留[22-23],但将该方法与SERS技术结合检测动物中氨基糖苷类药物残留的研究尚未见报道。研究拟以疏水性PP合成纸为衬底制备方阵排列SERS基底,通过QuEChERs方法对样品进行前处理,并对猪肉中氨基糖苷类抗生素残留进行定量分析,旨在为猪肉中氨基糖苷类抗生素残留提供快速、定量和高通量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯金酸、盐酸多巴胺、无水乙醇、4-巯基苯甲酸(4-MBA)、乙腈、乙酸、氯化钠、硫酸镁、氯化镁:分析纯,上海阿拉丁生化科技有限公司;

硫酸庆大霉素、硫酸新霉素:北京索莱宝科技有限公司;

PP合成纸:上海天成纸品纸业合作公司;

试验用水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 仪器与设备

场发射扫描电子显微镜:S-4800Ⅱ型,日本日立公司;

显微共焦拉曼光谱仪:Renishaw inVia型,英国Renishaw公司;

透射电子显微镜:Tecnai 12型,荷兰Philips公司;

透射电子显微镜:FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN型,美国FEI公司;

显微拉曼成像光谱仪:DXRxi型,美国Thermofisher公司;

紫外—可见分光光度仪:Cary UV-5000型,扬州贝欧生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 AuNFs的合成 取0.4 mL HAuCl4溶液(50 mmol/L)加入到含10 mL超纯水的烧杯中,剧烈搅拌混匀,加入0.8 mL盐酸多巴胺溶液(53 mmol/L),60 ℃水浴搅拌30 min,3 000 r/min离心10 min,去除上清液,向沉淀中加入1 mL超纯水,混匀得AuNFs溶液,4 ℃贮藏备用。

1.3.2 SERS基底的制备 将PP合成纸切割成2 cm×2 cm小块,并按3×3排列,在其表面滴50 mL AuNFs溶液,自然干燥即得研究使用的方阵排列SERS基底。

1.3.3 样品前处理 取10 g冷冻猪肉,研磨,倒入50 mL离心管中。将13.5 mL乙腈和300,150,75,15 mL乙酸滴入离心管中,得到的乙酸体积分数分别为2%,1%,0.5%,0.1%,并用超纯水定容到15 mL。加入脱水剂,涡旋振荡3 min,8 000 r/min离心5 min,取上清液于4 ℃贮藏备用。称取一定量的硫酸庆大霉素和硫酸新霉素,加入猪肉提取液并超声溶解。使用超纯水梯度稀释,最终得到浓度为1×10-10～1×10-3mol/L的猪肉提取液加标样品,并将样品滴加到制备好的基底表面,选择激发波长785 nm,曝光时间10 s和光源强度5 mW进行SERS检测。

增强因子(EF)是SERS检测领域的一个重要参数,表示信号分子与纳米结构表面相互作用的SERS信号的放大倍数。EF的计算需要仔细评估SERS和正常拉曼条件下的信号强度和分子数量,并按式(1)进行计算。

(1)

式中:

FE——增强因子;

ISERS——4-MBA标记的方阵排列SERS基底在当前浓度(CSERS)测量的SERS强度;

IRS——仅有4-MBA的PP合成纸在当前浓度(CRS)下的SERS强度。

1.3.4 SERS检测条件的优化 分别考察乙酸体积分数(2.0%,1.0%,0.5%,0.1%)、脱水剂种类(NaCl、MgSO4和MgCl2)及脱水剂添加量对1×10-6mol/L氨基糖苷类抗生素浓度的猪肉提取液加标样品SERS光谱图的影响。

1.3.5 数据分析 样本的拉曼光谱均采集3次,取平均值进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 AuNFs的表征

由图1可知,AuNFs表面有许多不规则的突起,大小均一,颗粒大小约为500 nm。晶面是晶体具有一定空间角度的一系列平行平面,用垂直于平面的矢量表示。AuNFs的晶面间距为0.24 nm,表明AuNFs优先在(111)晶面生长。AuNFs溶液在473 nm处有一个吸收峰。综上,通过一步合成法,简单、快速合成了大小均一,形貌均匀的AuNFs。

图1 AuNFs的结构表征图

2.2 方阵排列SERS基底的表征

由图2可知,PP合成纸表面有高密度的AuNFs,呈多层排列,可增强基底的SERS效应。SERS映射的颜色在1 077 cm-1处的特征峰较为规则,说明以PP合成纸为衬底的方阵排列SERS基底有良好的均匀性。4-MBA标记的方阵排列SERS基底有很强的SERS信号。当CSERS为1×10-6mol/L,CRS为1 mol/L时,EF为3.9×107,高于金纳米星的[24],表明AuNFs有很强的SERS表面增强效应。

图2 方阵排列SERS基底的表征图

使用4个不同批次的方阵排列SERS基底分别检测4-MBA,结果如图2(d)所示。4次SERS光谱波形相似且在1 077 cm-1处RSD为7.01%。因此,该基底表现出良好的重现性。将制备好的SERS基底于4 ℃静置1,7,14 d后,SERS光谱的波形和强度相似,且在1 077 cm-1特征峰处,贮藏14 d的SERS强度与贮藏1 d的相比仅下降了9.93%,说明AuNFs基底有较好的稳定性,具有疏水特性的PP合成纸阻止了水性AuNFs溶液吸收,并使AuNFs均匀地保留在PP合成纸表面,因此方阵排列SERS基底表现出良好的性能。

2.3 硫酸庆大霉素和硫酸新霉素的SERS光谱图

硫酸庆大霉素和硫酸新霉素的结构式如图3和表1所示。

表1 硫酸庆大霉素结构组成

图3 硫酸庆大霉素和硫酸新霉素的结构式

为了进一步定量检测猪肉中硫酸庆大霉素和硫酸新霉素残留,对其特征峰进行分析。由图4可知,硫酸庆大霉素和硫酸新霉素在997,1 074,1 572 cm-1处表现出明显的特征峰,分别由H—N—H摇摆振动、C—O拉伸振动和N—H的弯曲振动引起[25],因此将这些特征峰归属于氨基糖苷类抗生素分子的SERS特征峰。而硫酸庆大霉素和硫酸新霉素的SERS光谱图分别在475,619 cm-1处表现出微弱且独有的特征峰,是由H—N—H的扭转振动和N—H的弯曲振动引起。因此,选择475,619 cm-1处的峰作为硫酸庆大霉素和硫酸新霉素定性分析的特征峰,并以此处SERS信号强度确定最佳试验条件,对猪肉中氨基糖苷类抗生素残留进行定量分析。

图4 猪肉提取液的SERS光谱图

2.4 SERS检测条件的优化

2.4.1 提取液 由图5可知,当乙酸体积分数为1%时,硫酸庆大霉素和硫酸新霉素的特征峰明显。因此,采用90%乙腈(1%乙酸)水溶液作为提取液。

图5 乙酸体积分数对硫酸庆大霉素和硫酸新霉素SERS光谱图的影响

2.4.2 脱水剂种类 由图6可知,加入NaCl时,氨基糖苷类抗生素SERS特征峰明显,因此,选择NaCl作为脱水剂。

图6 脱水剂种类对硫酸庆大霉素和硫酸新霉素SERS光谱图的影响

2.4.3 脱水剂添加量 由图7可知,当NaCl添加量为2 g时,硫酸庆大霉素和硫酸新霉素分别在475,619 cm-1特征峰处SERS强度最大,说明此时的脱水效果最佳。因此,选择2 g NaCl作为脱水剂。

图7 NaCl添加量对硫酸庆大霉素和硫酸新霉素SERS强度的影响

2.5 猪肉中氨基糖苷类抗生素的定量分析

由图8可知,随着加标浓度的增加,硫酸庆大霉素和硫酸新霉素对应特征峰SERS强度逐渐增强。硫酸庆大霉素加标浓度为1×10-10mol/L的样品在1 074,1 572 cm-1处有特征峰,但由于氨基糖苷类抗生素特征峰的共性,仅能将其定性为氨基糖苷类抗生素残留,不能定性为硫酸庆大霉素残留;而在475 cm-1处未表现出明显的特征峰,因此选择1×10-9mol/L作为硫酸庆大霉素的最低检测限(LOD)。硫酸新霉素加标浓度为1×10-9mol/L的样品在619 cm-1处未表现出明显的特征峰,因此选择1×10-8mol/L作为硫酸新霉素的LOD。在475 cm-1特征峰处建立猪肉提取液硫酸庆大霉素加标样品的SERS强度与浓度(1×10-9～ 1×10-3mol/L)的对数的标准曲线,线性回归方程为y=395.98x+4 845.37,相关系数(R2)为0.991 6。在619 cm-1特征峰处建立猪肉提取液硫酸新霉素加标样品的SERS强度与浓度(1×10-8～ 1×10-3mol/L)的对数的标准曲线,线性回归方程为y=1 080.78x+9 280.72,R2为0.990 7。因此,方阵排列SERS基底可实现猪肉提取液加标样品的定量检测。

图8 猪肉提取液硫酸庆大霉素和硫酸新霉素加标样品的SERS光谱图

由表2可知,试验采用的方阵排列SERS基底检测灵敏度高,仅次于间接竞争性化学发光酶免疫分析,且检测速度快,有较好的稳定性,因此SERS技术对氨基糖苷类抗生素的检测具有较高的应用前景。

表2 基于不同方法检测氨基糖苷类抗生素

2.6 实际样品中氨基糖苷类抗生素的测定

在最佳检测条件下,猪肉样品中未检出氨基糖苷类抗生素残留,说明该猪肉符合国家检测标准。为验证SERS方法的可行性,对1×10-6mol/L氨基糖苷类抗生素加标浓度的猪肉提取液样品进行检测,结果见表3。由表3可知,试验方法的检测回收率和酶联免疫法的相近,结果无显著性差异(P>0.05),且RSD均<8%,表明基于方阵排列SERS基底对猪肉中氨基糖苷类抗生素残留的检测方法具有较高的准确性和可行性。

表3 实际样品中氨基糖苷类抗生素残留的检测结果

3 结论

研究以疏水性PP合成纸为衬底,制备了一种基于AuNFs的方阵排列SERS基底。通过与QuEChERS方法结合,快速、定量和高通量检测猪肉中氨基糖苷类抗生素残留。基于PP合成纸的疏水特性,AuNFs聚集更加紧密,使该基底具有良好的均一性、稳定性和SERS增强效应。与传统检测方法相比,基于方阵排列SERS基底的检测方法更加方便快捷、灵敏度高。后期探究不同肉类样品对SERS信号的影响,实现肉类样品中抗生素残留经济、高效、高灵敏的检测。