麻疯树提取物活性物质及抗菌作用研究

何 静，李佛生，王晶金，高婷彦，颜 钫，唐 琳

（四川大学 生命科学学院，四川 成都 610064）

0 引言

麻疯树（Jatropha curcas L.）是大戟科（Euphorbiaceae）麻疯树属（Jatropha）植物，小乔木或灌木，在我国，麻疯树主要分布于广东、广西、海南、云南、四川、贵州、台湾、福建等省区［1］。麻疯树种子含油量高达40%，是理想的生物能源植物，具有很高的经济价值［2］。除了作为油料作物，麻疯树中还含有其他丰富的化学成分，目前已从麻疯树中鉴定出数百种化合物［3-5］。徐俊驹等对麻疯树酚性成分进行了研究，从麻疯树茎的甲醇提取物中分离并鉴定了14个酚性化学成分［6］；马惠芬等对麻疯树树叶的挥发性化学成分进行了研究，利用乙醇回流法进行提取，最终鉴定出40 种化合物，包括醛、酮、酯、萜类化合物等［7］。药理学分析表明麻疯树提取物具有抗菌［8］、抗 病 毒［9］、抗 炎［10］、抗 氧 化［11］等 生 物 活性［12］。陆志科等对麻疯树叶的抗菌作用进行了研究，通过抑菌圈实验，发现麻疯树叶乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较好的抑制效果，对霉菌和酵母菌的抑制效果较弱，测得大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC 为0.156mg/L［8］；Rahu等对麻疯树不同部位进行提取研究，结果表明，其提取物具有抗细菌和抗真菌活性［13］。但大量研究都集中在酚类和萜类化合物中，对于香豆素类化合物的活性成分及作用机理研究较少。

高效液相色谱—质谱串联分析（LC -MS/MS）将液相色谱的良好分离性与质谱选择灵敏性好结合起来，鉴于传统分离鉴定方法耗时且繁琐，更快速的达到对天然产物化学成分解析的目的。同时辅以标准物质比对，能够准确地对化学物质进行定性和定量［14］。如张晨曦等应用LC -MS 在正负离子模式下分析连翘中的主要化学成分，鉴定了24 个化合物，其中有5 个化合物：3，4 -二羟基苯乙醇苷、2 -甲氧基-3，4，5 -三羟基苯乙醇苷、β -羟基化连翘酯苷H、6 -羟基二氢黄酮、二氢杨梅素为首次从连翘中得到鉴定［15］。

香豆素类化合物是一类含苯骈α 吡喃酮结构的芳香含氧杂环化合物，在中药材中广泛存在，具有抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化等多种生物活性［16］。研究发现，天然香豆素类化合物具有良好的抗菌效果，花椒毒酚、异茴芹内酯等表现出了对金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑制作用［17］。香豆素化合物具有分子量小、结构类型丰富、抗菌活性强等优点，具有良好的抗菌潜能［18］。

本文通过乙醇—乙酸（1∶ 1）混合溶剂，提取麻疯树中的香豆素类化合物，采用LC -MS 进行定性及定量分析。此外，通过体外抑菌实验验证麻疯树提取物的抑菌效果，进而采用肉汤微量稀释法测定麻疯树提取物的MIC和MBC，最后通过生长曲线进一步验证了麻疯树提取物的抑菌效果及麻疯树枝叶中香豆素类化合物的抗菌机制。

1 材料、仪器及试剂

1.1 材料

麻疯树新鲜枝叶（10 年以上树木的新鲜枝叶）：2022 年4 月采自四川省凉山州金阳县，由四川德农生物能源股份有限公司提供。大肠杆菌（E.coli）ATCC25922、金黄色葡萄球菌（S.aureus）ATCC25923购自上海保藏生物技术中心。

1.2 仪器及试剂

主要仪器：RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；JP-500B -8 高速多功能粉碎机（上海市久品工贸有限公司）；电子精密分析天平（瑞士Mettler公司）；液相色谱串联飞行时间高分辨质谱仪（SCIEX QToF 5600 ＋）、液相色谱串联三重四极杆质谱仪（SCIEX Triple Quad QqQ 5500）；连续波长酶标仪（Thermo scientific）。

主要试剂：甲醇（色谱纯）购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司；乙醇、乙酸（分析纯）购于成都科龙化工试剂厂；佛手柑内酯、黄芩素、野漆树苷标准品购于上海诗丹德生物技术有限公司。

2 实验方法

2.1 麻疯树提取物样品的制备

采用双溶剂法进行提取，将麻疯树新鲜枝叶于粉碎机中粉碎后，称取麻疯树粉末按1∶ 20、1∶ 15料液比于95%乙醇和乙酸（1∶ 1）混合的溶剂中，70℃水浴提取2h，过滤，收集滤液，滤渣按粉末重1∶ 15料液比于95%乙醇和乙酸（1∶ 1）混合的溶剂中，70℃水浴提取2h，过滤，合并两次滤液，用旋转蒸发仪60℃浓缩至浸膏状，以蒸馏水溶出，将样品置于-80℃中预冻24h，随后于冻干机中-80°C，真空度9pa 条件下冻干24h，收集冻干样品，置于-20℃冰箱中密闭冷藏备用。用蒸馏水稀释样品粉末至1.2mg/mL，得麻疯树提取物（JE）用于抑菌实验。

2.2 紫外扫描吸收光谱

将麻疯树提取物粉末用甲醇配制成0.5mg/mL的溶液，于连续波长酶标仪上在200nm—1 000nm间进行吸收光谱扫描。

2.3 LC-MS非靶标分析

2.3.1 色谱—质谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18 色谱柱（2.1mm×100mm，1.8μm），流动相A 为0.1%甲酸水溶液，B 为乙腈，流速0.4mL/min，采用梯度洗脱方法：2%B（0—1min），2%—95%B（1—10min），95%B（10—12min），95%—2%B（12—12.1min），2%B（12.1—15min）；样品室温25℃、柱温40℃；进样量10μL。

离子源：电喷雾离子源（ESI ＋）；扫描方式：正负离子扫描；正离子模式下，喷雾电压：5 500v；去溶剂温度：500℃；气帘气：35psi；雾化气：50psi；辅助加热气：50psi；负离子模式下，喷雾电压：-4 500v；去溶剂温度：500℃；气帘气：35psi；雾化气：50psi；辅助加热气：50psi。

2.3.2 样品制备

称取制备的麻疯树提取物粉末，用甲醇制备成500ng/mL样品液，乙醇和乙酸按1：1 混合作空白对照，0.22μm PVDF微孔滤膜过滤后备用。

2.4 定量分析

2.4.1 色谱条件

色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18（2.1mm ×100mm，1.9μm），流动相A 为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，流速0.4mL/min，采用梯度洗脱方法：5%B（0—0.5min），5%—95% B（0.5—6min），95% B（6—8min），95%—5%B（8—8.1min），5%B（8.1—10min）；样品室温25℃、柱温40℃；进样量1μL。

2.4.2 标准品溶液的制备

精密称取黄芩素、野漆树苷、佛手柑内酯标准品适量，用80%色谱甲醇分别配制成1mg/mL 母液。将各对照品原液梯度稀释后用于标准曲线测定，具体稀释浓度如表1 所示。

表1 黄芩素、佛手柑内酯、野漆树苷的标准曲线浓度Table 1 Gradient dilution of control stock solution

2.4.3 样品溶液的制备

称取制备的麻疯树提取物样品粉末（JE），使用80%甲醇（色谱级）配制成500ng/mL 样品液，0.22μm PVDF微孔滤膜过滤后备用。

2.5 体外抑菌实验

培养基的制备。LB 肉汤培养基：取蛋白胨10.0g，酵母膏粉5.0g，氯化钠10.0g，加1 000mL 蒸馏水，加热溶解，121℃灭菌20min；LB 琼脂培养基：取蛋白胨10.0g，酵母膏粉5.0g，氯化钠10.0g，琼脂20g，加1 000mL 蒸馏水，加热溶解，121℃灭菌20min。MH液体培养基：称取22g 培养基干粉加1 000mL蒸馏水溶解，121 ℃灭菌20min。

菌悬液的制备。将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌冻干粉活化，全部接种至2 只斜面上于37 ±1℃恒温培养箱中培养18—24h。用接种环挑取菌接种于50mLLB液体培养基中，37 ±1℃恒温培养箱中培养12—18h，使用LB 肉汤培养基调整菌液浓度，以此作为后续实验菌悬液，菌悬液在4℃条件下保存。将试管斜面贮存于4℃冰箱内作为保存菌备用。

抑菌活性的测定。采用滤纸片法测定麻疯树提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌活性。取用冷却至55℃左右的LB 琼脂培养基20mL 于无菌平板中，加入100μL 菌悬液涂布均匀，制成检测平板备用。将浸泡麻疯树样品稀释液的6mm 饱和滤纸片晾干，贴在检测平板表面，倒置于37 ± 1℃恒温培养箱内培养24h，观察抑菌圈，测量抑菌圈直径大小，以75%乙醇作为阳性对照。

菌落计数实验。将0.5mL 菌液放入4.5mL 样品中反应10min后，将反应后的样品液梯度稀释后取100μL涂布平板，倒置于37 ±1℃恒温培养箱内培养24h后，选择菌落数为30—300 的平板测量菌落个数，以无菌水作为对照。计算杀灭对数值，计算公式为：杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）-实验组活菌浓度对数值（Nx）。

参考CLSI M07 -A9 方法［19］，采用肉汤微量稀释法测定提取物的MIC 和MBC。取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌液，MH 液体培养基调整菌体浓度为1 ×106CFU/mL，加入提取液使终浓度分别为0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25 和12.5mg/mL，加入等体积的生理盐水为阳性对照，以不加菌液的培养基作为阴性对照。37℃培养24h，观察细菌生长状况，与阴性对照相比无显著变化为MIC，吸取100μL上述培养液涂布，37℃培养24h，观察菌落形成情况，将不长菌落的平板所对应的浓度定为MBC。

生长曲线的测定。将细菌菌液用LB 液体培养基调整菌体浓度为108CFU/mL。向含菌LB培养基中加入提取物使其最终浓度分别为1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC，加入等体积0.85 %生理盐水作为对照，头孢作为阳性对照，37℃下180r/min 培养。每隔2h 取样，测定600nm波长处的吸光值，连续测定24h。

3 结果及分析

3.1 麻疯树提取物紫外光谱扫描结果

将麻疯树提取物在200—1 000nm 范围内进行光谱扫描（图1），麻疯树提取物在275nm、287nm、310nm处出现吸收峰。未取代的香豆素，其紫外吸收光谱一般可呈现275nm、284nm和310nm3 个吸收峰［20］，表明麻疯树提取物中主要成分为香豆素类化合物。

图1 麻疯树提取物200—1 000nm光谱扫描结果Figure 1 Spectral scan of Jatropha curcas extracts at 200 -1 000nm

3.2 麻疯树香豆素类化合物非靶标物质筛选

本实验采用了LC -MS，对麻疯树树叶样品粗提液中的化学成分进行定性分析（表2）。经数据库比对及文献查阅从麻疯树提取液中确定了11 种物质，如2S-2 -羟基丁二酸、原儿茶酸、葡萄糖酸等。

表2 麻疯树提取物化学成分分析结果Table 2 The results of component identification of J.curcas by LC-MS

3.3 麻疯树3 种单体化合物定量分析

紫外光谱分析表明，麻疯树提取物中主要成分为香豆素类化合物。通过非靶标筛选到具有抑菌作用的佛手柑内酯。在提取物中，同时还发现了具有抑菌作用黄芩素、野漆树苷。对佛手柑内酯、黄芩素和野漆树苷进行定量分析，其标准品与样品提取的离子流图如图2—4 所示。结果（表3、图5—7）表明，佛手柑内酯相对含量最高，达18.66%，黄芩素次之（2.76%），野漆树苷含量最少（0.16%）。佛手柑内酯为首次在麻疯树化学成分鉴定中发现。

图2 佛手柑内酯标准品与麻疯树样品的提取离子流Figure 2 Ion chromatogram shows the calibration standard of Bergapten and JE sample.

图3 黄芩素标准品与麻疯树样品的提取离子流Figure 3 Ion chromatogram shows the calibration standard of Baicalein and JE sample.

图4 野漆树苷标准品与麻疯树样品的提取离子流Figure 4 Ion chromatogram shows the calibration standard of Rhoifolin and JE sample.

图5 佛手柑内酯标准曲线Figure 5 The standard curve of Bergapten

图6 黄芩素标准曲线Figure 6 The standard curve of Baicalein

图7 野漆树苷标准曲线Figure 7 The standard curve of Rhoifolin

表3 麻疯树提取物中3 种化合物的定量分析结果Table 3 The quantitative analysis of three compounds in JE

3.4 JE对S.aureus、E.coli的抑菌活性结果

为了探究JE的抑菌活性，研究选取金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）作为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的代表，测定了抑菌圈直径（表4）。经过JE处理培养24h后发现，与75%乙醇处理相比，S.aureus和E.coli均产生明显的抑菌圈，最大抑菌圈直径达14.43 mm。在对JE 进行稀释后，结果表明50%浓度的提取物处理时，S.aureus和E.coli依然可以形成明显的抑菌圈；10%浓度的提取物处理时，S.aureus 和E.coli 的抑菌圈消失（图8），表明JE对S.aureus和E.coli的抑制效果呈剂量依赖性。实验证明JE 显著抑制S.aureus 和E.coli的生长。

图8 （A）麻疯树提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性（B）麻疯树提取液对大肠杆菌的抑菌活性Figure 8 （A）Bacteriostatic activity of Jatropha curcas extract against S.aureus（B）Bacteriostatic activity of Jatropha curcas extract against E.coli.

表4 JE对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径Table 4 Diameters of antibacterial circles when S.aureus and E.coli.treated with JE.

进一步对抑菌圈的直径进行显著性分析。由图9 可见，JE 各处理组对S.aureus 和E.coli 的抑菌圈直径均显著大于75%乙醇处理组，JE不同处理组对S.aureus的抑菌圈直径均与E.coli 有显著性差别。将JE 处理菌液10 min 后进行平板涂布，结果证明实验组平板上均无菌落生长，其杀灭对数值分别达8.7、8.79（表5）。证明麻疯树提取物对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有良好的抑制效果，且对于金黄色葡萄球菌的抑制效果优于大肠杆菌。

图9 JE对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径Figure 9 Diameters of antibacterial circles when S.aureus and E.coli.treated with JE.

表5 JE的杀灭对数值Table 5 Killing log value of JE

3.5 最小抑菌浓度和最低杀菌浓度测定

通过肉汤微量稀释法测定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC和MBC（表6）。由表6 可见，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC分别为1.56 mg/mL和3.125 mg/mL，MBC为6.25 mg/mL。

表6 JE的MIC和MBCTable 6 MIC and MBC measurement of JE treatment

3.6 JE对S.aureus、E.coli的生长曲线测定

以不同浓度的麻疯树提取物（1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC）处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，并用头孢处理作为阳性对照，测定其生长情况进一步验证麻疯树提取物的杀菌作用（图10、11）。

图10 JE对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响Figure 10 Effect of JE on the growth curve of S.aureus

图11 JE对大肠杆菌生长曲线的影响Figure 11 Effect of JE on the growth curve of E.coli

从图10、11 可见，对于金黄色葡萄球菌，细菌的生长速度随着JE 的浓度升高而减慢。在前8h，细菌迅速生长，8h 后生长速度变慢，MIC 处理组和头孢（阳性对照）处理组的OD 值在24h 内无明显变动。对于大肠杆菌，对照组生长长势良好，1/2MIC组在8 h 后开始生长，MIC 处理组和头孢（阳性对照）处理组OD值无明显变化。

4 讨论

植物是提取天然产物的重要来源，为药理学研究提供了丰富的资源［21］。麻疯树作为能源资源植物，枝叶在民间习用于体外给药［13］。在抗炎，抗菌，抗肿瘤方面，目前已经成为研究热点。然而，麻疯树中具有活性成分的单体化合物依然不明确。

香豆素类化合物广泛存在于植物中，目前在麻疯树中鉴定出的香豆素类化合物包括5 -羟基-6，7 -二甲氧基香豆素、5，6 -二羟基-7 -甲氧基香豆素（Isofraxetin）、异紫花前胡内酯（Marmesin）、Propacin、东莨菪素（Scopaletin）、6 -甲氧基-7 -羟基香豆素、麻疯树素（Jatrophin）等［4］。本研究经数据库比对、查阅文献等，首次在麻疯树中鉴定得到佛手柑内酯（Bergapten）。将干燥枝叶采用同样的提取方法进行提取，也鉴定到了佛手柑内酯，推测是由于提取方法的改变，以往麻疯树树枝叶的提取方法主要是利用甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯等溶剂进行提取［4］，由于乙酸乙酯在生产应用上具有爆炸的风险，因此我们采用乙醇＋乙酸双混合溶剂的提取方法。此外，本研究使用高效液相色谱-质谱串联分析，对提取物中的片段进行鉴定，具有高灵敏度，高精度的特点。通过数据库进行比对，可以发现更多未知的化学成分。因此，本研究采用双溶剂法提取，结合高效液相色谱—质谱串联分析，首次从麻疯树提取物中鉴定到佛手柑内酯。

有研究表明，植物的提取物具有抑菌活性。Auwal研究发现麻疯树根皮水浸提液具有抑菌活性，作用浓度为12.5mg/mL［22］；Igbinosa在对麻疯树茎皮的抑菌活性的研究中发现其甲醇提取物、乙醇提取物、水提取物均显示抑菌活性，能够抑制酵母菌、念珠菌等真菌生长［23］。本研究使用乙醇和乙酸（1：1）混合提取了麻疯树枝叶提取液，对大肠杆菌的MIC为3.125mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC为1.56mg/mL，表现出良好的抑菌活性。经LC -MS鉴定了三种化合物，其中佛手柑内酯含量最高。既往研究表明，佛手柑内酯有抗炎、抗菌及预防骨质疏松等多重作用［24］。Golfakhrabadi 研究发现佛手柑内酯对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌具有抑制作用，且推测其C5 上的OCH3基团是抑菌活性的功能位点［25］。与前人研究结果一致，本研究经体外抑菌实验证实了麻疯树中的香豆素类化合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用，其杀灭对数值分别达8.7、8.79。

在对抑菌活性的研究中，不同浓度处理下细菌的生长情况反映了该药物对细菌的抑制情况，对药物的剂量研究有非常重要的参考价值。Lovato等研究了绿茶提取物的抑菌活性物质，生长曲线表明，提取物对单芽孢杆菌具有抑制作用［26］；岳明等通过生长曲线测定法，对洋甘菊残渣乙酸乙酯提取物进行了抑菌测试并发现其显著抑制了对数期金黄色葡萄球菌的生长［27］。本研究分析了麻疯树提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长曲线的影响，结果发现，在MIC浓度下，麻疯树提取物可完全抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长；1/4 MIC和1/2 MIC浓度不能完全抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，表明麻疯树提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用存在剂量依赖性。

5 结论

本研究通过乙醇—乙酸回流法从麻疯树提取物中定量了三种具有抑菌作用的化合物，其中佛手柑内酯含量最高，相对含量达18.66%。体外抑菌实验证明麻疯树提取物具有良好的抑菌效果，在浓度为1.56mg/mL时可对金黄色葡萄球菌产生抑制生长的作用。佛手柑内酯作为其中的香豆素类化合物，是麻疯树枝叶抑菌的有效活性成分之一，后续有待对其作用机制进行进一步研究。