鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性研究

摘 要：目的：对鸡源产气荚膜梭菌进行分离、鉴定和耐药性研究，以深入了解其生物学特性和潜在威胁。方法：利用TSC琼脂、血琼脂、硫酸亚铁牛乳培养基等进行分离培养，通过形态观察、生化特性鉴定，以及PCR鉴定和耐药性试验等多种方法，系统性地分析产气荚膜梭菌的性状和特性。结果：分离得到的3株产气荚膜梭菌经PCR鉴定均确认为A型。生化鉴定结果显示了其在碳源代谢上的多样性。毒素分型和16S rRNA基因分析验证了其种属身份，同时揭示了它们在分子水平上的相似性。耐药性试验结果表明，这些分离株对庆大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B和复方新诺明表现出耐药性，对头孢唑啉、头孢曲松、头孢呋辛、氨苄青霉素和哌拉西林等抗生素则表现出高度敏感性。结论：本研究全面研究了鸡源产气荚膜梭菌的分子生物学特性，强调了其在碳源代谢和抗药性方面的多样性，为防控鸡源产气荚膜梭菌感染提供了重要的基础数据，同时为未来深入探究其致病机制和合理使用抗生素提供了科学依据。

关键词：鸡源产气荚膜梭菌；分离鉴定；耐药性

Isolation and Identification of Clostridium perfringens from Chickens and Their Drug Resistance

WANG Yanchun

（Chifeng City Center for Disease Control and Prevention， Chifeng 024000， China）

Abstract： Objective： To investigate the isolation， identification and drug resistance of Clostridium perfringens of chicken origin in order to understand its biological characteristics and potential threats. Method： TSC AGAR， blood AGAR and ferrous sulfate milk culture medium were used to isolate and culture the characters and characteristics of Clostridium perfringens were analyzed systematically by morphological observation， biochemical characterization， PCR identification and drug resistance test. Result： The three isolates of Clostridium perfringens were identified as type A by PCR. The results of biochemical identification showed the diversity of carbon source metabolism. Toxin typing and 16S rRNA gene analysis confirmed the species identity and revealed their similarity at the molecular level. Resistance tests showed that these isolates were resistant to gentamicin， kanamycin， neomycin， polymycin B and cotrimoxazole， while highly sensitive to cefazolin， ceftriaxone， cefuroxime， ampicillin and piperacillin. Conclusion： This study comprehensively studied the molecular biological characteristics of Clostridium perfringens of chicken， emphasizing its diversity in carbon source metabolism and drug resistance， providing important basic data for the prevention and control of Clostridium perfringens infection， and providing scientific basis for further investigation of its pathogenic mechanism and rational use of antibiotics in the future.

Keywords： Clostridium perfringens of chicken origin; isolation and identification; drug resistance

鸡源产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）作为一种革兰氏阳性、芽孢形成的厌氧菌，广泛分布于自然界中，尤其在禽畜的肠道内得以繁衍生息。其菌体形态特征包括短杆状，能够产生耐高温的孢子，在恶劣环境中存活能力极强。作为一类潜在的食源性病原微生物，鸡源产气荚膜梭菌的主要毒力因子之一即为产气荚膜，是一种多糖复合物，对其致病性起着重要的作用。这种荚膜不仅使得细菌在寄主体内逃避免疫系统的清除，还为其生存提供了一层保护膜，使得细菌能够在寄主体内迅速繁殖，形成感染[1-2]。此外，鸡源产气荚膜梭菌还能分泌多种毒素，包括α、β、ε和ι毒素，这些毒素协同作用，能够引发多种疾病，如坏疽性肠炎、风湿性关节炎等。鸡源产气荚膜梭菌在禽畜的肠道中普遍存在，其过度增殖或毒力因子释放过多可能引发严重的动物和人类疾病。在禽类养殖业中，该菌株可引起坏疽性肠炎等消化系统疾病，对禽畜的生长和发育产生不可忽视的影响[3-4]。因此，本文将聚焦于探究鸡源产气荚膜梭菌的危害机制，包括其毒力因子的作用机制以及其在动物体内的生存策略，通过深入了解其引发的疾病机制，可以更好地制定预防和控制策略，减少其对禽畜养殖业和食品安全的潜在威胁。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

TSC琼脂、血平板琼脂、硫酸亚铁牛乳培养基等，上海广锐生物科技有限公司；DNA质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，上海莼试生物技术有限公司；PCR反应试剂，上海广锐生物科技有限公司；微生物发酵反应管，上海莼试生物技术有限公司；TaqMan实时荧光定量PCR仪，Applied Biosystems；液体硫乙醇酸盐培养基（Fluid Thioglycollate medium，FTG）、缓冲动力硝酸盐培养基、硝酸盐还原试剂、乳糖明胶培养基，青岛海博生物有限公司；SPF鸡胚，北京梅里亚维通实验动物有限公司。

1.2 分离培养和形态观察

称取禽畜的肠道样本原液25 mL，加入含有225 mL 0.1%蛋白胨水无菌均质袋中，均质化处理。取均质处理后的液体1 mL，加入9 mL 0.1%蛋白胨水无菌管中混匀，得到1∶1 000的稀释液。从稀释液中取2 mL分别加入2个无菌平皿中，每个平皿倒入15 mL 50 ℃ TSC琼脂，缓慢转动平皿以混匀液体，待凝固后加入10 mL冷却至50 ℃的TSC琼脂均匀覆盖平板表层。随后，将平板正置于厌氧盒装置内，在36 ℃条件下厌氧培养20 h，可见TSC琼脂平板上形成的黑色菌落。引入SPF鸡胚的模型系统，模拟产气荚膜梭菌在禽体内的生存环境。

形态观察阶段，采用TaqMan实时荧光定量PCR仪对分离得到的潜在产气荚膜梭菌进行16S rRNA基因的扩增。扩增反应结束后，进行凝胶电泳验证，确保目标片段的特异性和纯度。然后，通过测序技术对扩增得到的16S rRNA基因序列进行分析，以此推断种属鉴定和系统进化关系。通过单菌株分离纯化技术，将分离得到的3株菌株分别命名为TA01、TA02、TA03，以备进一步研究。

1.3 生化特性鉴定

为获得单一纯种的产气荚膜梭菌菌株，用接种针挑取5个黑色可疑菌落分别划线于TSC平板上进行纯化培养，然后接种到FTG培养基中，36 ℃培养20 h，取生长旺盛的产气荚膜梭菌1 mL，接种于含铁牛乳培养基中，46 ℃培养2 h呈爆裂发酵。取FTG培养液穿刺接种缓冲动力硝酸盐培养基，可观察到无气泡产生，然后滴加0.5 mL试剂甲和0.2 mL试剂乙，15 min内观察到培养基变为红色，则表明硝酸盐已被还原成亚硝酸盐。同时，菌株能够发酵乳糖、液化明胶，并分解卵磷脂。

1.4 毒素分型

采用分子生物学技术对鸡源产气荚膜梭菌的主要毒力因子进行鉴定。从培养的鸡源产气荚膜梭菌中提取DNA，将其放入离心管中。设计产气荚膜梭菌鉴定引物，选择包括cpa、cpb、etx、iap和cpb2在内的5个关键基因，这些基因编码产气荚膜梭菌的α、β、ε和ι等主要毒素。根据这些毒素基因的序列特点设计多重PCR反应，PCR反应的参数设置：反应体系为50 μL，包括10×反应缓冲液2.5 μL、2.5 mmol·L-1 dNTP混合液1 μL、10 μmmol·L-1引物混合液2 μL、模板DNA 2 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、硫酸镁2.5 μL，超纯水填充至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，随后进行35个循环，每个循环包括94 ℃变性30 s、相应温度退火30 s、72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸10 min。反应结束后，通过电泳分析对PCR产物进行检测，以确认产气荚膜梭菌毒素基因的存在与否。

1.5 α毒素基因与16S rRNA基因分析

在α毒素基因与16S rRNA基因分析阶段，采用分子生物学方法，通过PCR技术对鸡源产气荚膜梭菌的α毒素基因和16S rRNA基因进行克隆与扩增。从培养得到的产气荚膜梭菌中提取DNA，将其作为模板进行反应。为了克隆α毒素基因，设计特异性引物cpa（k）。扩增结束后，通过电泳对PCR产物进行检测，以验证α毒素基因的存在。同时，对16S rRNA基因进行扩增，PCR反应的条件和步骤同α毒素基因扩增类似，同时通过电泳检测确保16S rRNA基因的成功扩增。随后，对两者的PCR产物进行纯化和测序，通过比对基因序列确保所得到片段的准确性。

1.6 耐药性试验

将分离得到的鸡源产气荚膜梭菌菌株接种于FTG培养基，培养温度设定为37 ℃，培养时间为24 h，模拟其在宿主体内的生存环境。将菌液分别均匀涂布于TSN平板上，分别取适量庆大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B、复方新诺明、头孢唑啉、头孢曲松、头孢呋辛、氨苄青霉素和哌拉西林等药敏纸片贴在培养基表面，于37 ℃条件下孵育24 h，之后观察和记录不同抗生素对菌株的抑菌效果，通过抑菌圈直观判断耐药性。

2 结果与分析

2.1 产气荚膜梭菌分离

在37 ℃厌氧培养24 h后，观察到菌落呈典型的圆形、表面光滑、边缘整齐。产气荚膜梭菌在FTG培养基上呈现出较好的生长状态，菌体呈现短杆状，形态鲜活。显微镜形态观察到了产气荚膜梭菌的特有荚膜结构。在TSB肉汤中进行16S rRNA基因的PCR扩增和测序后，得到了产气荚膜梭菌的16S rRNA基因序列。比对数据库进行结果鉴定后得出本文分离得到的菌株与鸡源产气荚膜梭菌的16S rRNA序列高度一致，验证了其种属身份。详见表1。

2.2 生化鉴定结果

为验证生化反应鉴定结果，以氧气需求、革兰染色、革兰阳性等作为判定指标，反应结果见表2。结果表明，得到3株分离株的主要代谢特征的结果均符合产气荚膜梭菌的生化反应。

2.3 产气荚膜梭菌的PCR鉴定

PCR扩增使用了特异性引物，分离株TA01、TA02和TA03的PCR反应产物经电泳分析后显示出预期长度的明亮条带，与A型产气荚膜梭菌的PCR产物相一致。这些PCR产物的特征性长度对应了cpa、cpb、etx、iap和cpb2等毒素基因的扩增片段，进一步证实了这3株分离株为A型产气荚膜梭菌。目的基因扩增引物见表3。

2.4 α毒素和16s RNA基因分析结果

通过α毒素和16S rRNA基因分析，获得了关于产气荚膜梭菌的分子水平特征的详细数据。结果表明，PCR扩增得到的α毒素基因片段长度符合预期，分离株TA01、TA02和TA03均显示了清晰而一致的目的基因片段。经过电泳分析，分离株TA01、TA02和TA03的α毒素基因片段分别为600 bp、590 bp和610 bp，与α毒素的特征性大小相符。对16S rRNA基因的PCR扩增结果进行测序和分析，得到了分离株TA01、TA02和TA03的16S rRNA基因序列。比对数据库后，测序结果显示这3株分离株的16S rRNA基因序列与鸡源产气荚膜梭菌的已知序列高度一致，相似性均超过99%。详见表4。

该结果明确了分离株TA01、TA02和TA03为A型产气荚膜梭菌，其α毒素基因的存在和16S rRNA基因的高度相似性验证了其属于鸡源产气荚膜梭菌，这些数据为产气荚膜梭菌种属鉴定提供了证据，同时也为后续的耐药性和毒力机制研究提供了基础。

2.5 耐药性试验结果

耐药性试验结果显示（表5），3株分离的产气荚膜梭菌均表现出相似的耐药性特征。对于庆大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B和复方新诺明，3株分离株均表现出耐药性。对于头孢唑啉、头孢曲松、头孢呋辛、氨苄青霉素和哌拉西林等药物，3株菌株均表现出高度的敏感性。相对而言，它们对红霉素、克林霉素、丁胺卡那霉素等药物的敏感性呈现出不同程度的变化。耐药性结果为了解这些分离株在不同药物压力下的适应性提供了重要线索，对于合理使用抗生素和制定治疗方案具有指导意义。

3 结论与讨论

产气荚膜梭菌是一种会引发严重健康问题的潜在食源性病原体，对养禽业和人类健康构成潜在威胁。其在动物的肠道内会产生毒素，容易引发食物中毒的潜在危险，导致胃肠道疾病，如腹泻、腹痛、呕吐等症状，给个体健康带来严重威胁。在养禽业中，尤其是家禽养殖过程中，产气荚膜梭菌的感染可能导致严重的禽流感，给养殖业带来沉重的经济损失。这一病原体不仅影响禽类的生长发育，还可能导致大量禽畜的死亡，给养殖者和整个产业链带来不可忽视的影响。禽流感的暴发会引起广泛的贸易禁运和动植物检疫措施，对农业经济造成重创。因此，防范和控制产气荚膜梭菌的感染对于维护禽类健康和农业产业的可持续发展至关重要[5]。

本研究对鸡源产气荚膜梭菌展开了分离、鉴定和研究，实验结果显示，分离的3株产气荚膜梭菌为A型，并通过生化鉴定展示了它们在碳源代谢上的多样性。通过PCR鉴定和毒素分型，本文明确了A型产气荚膜梭菌的毒力基因特征，尤其是α毒素的存在，进一步揭示了其在机体内引发疾病的分子机制。A型产气荚膜梭菌的主要致死性毒素是α毒素，α毒素由cpa基因编码，具有磷脂酰肌醇酶活性，可引起细胞膜的破坏，导致细胞溶解和组织破坏。在机体内，α毒素的活性主要表现在红细胞、血管内皮细胞和其他细胞上，容易引发溶血、血栓形成以及炎症反应。此外，α毒素还能够干扰免疫系统的正常功能，削弱宿主的抵抗力。本研究采用K-B纸片法对分离株进行药物敏感性试验，系统地评估了这些产气荚膜梭菌对

13种抗生素的反应情况。结果表明，这3株A型产气荚膜梭菌在药物敏感性方面存在一定的差异。分离株对庆大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B和复方新诺明表现出耐药性，对头孢唑啉、头孢曲松、头孢呋辛、氨苄青霉素和哌拉西林等抗生素则表现出高度敏感性。值得注意的是，这种耐药性的差异性可能归因于不同分离株之间存在的遗传变异或者环境因素的压力选择。庆大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B和复方新诺明等抗生素广泛应用于畜禽养殖中，因此对这些抗生素的耐药性研究具有重要的研究意义。此外，研究头孢唑啉、头孢曲松、头孢呋辛、氨苄青霉素和哌拉西林等抗生素的高度敏感性可为制定合理的养殖管理和抗生素使用政策提供指导。

针对产气荚膜梭菌的防控，建议采取综合的对策。①加强对养殖环境的卫生管理，确保禽畜的饮食和生活环境卫生；②定期对禽畜进行健康监测，一旦发现异常情况，应及时采取隔离措施；③合理使用抗生素，避免滥用，以减少耐药性的发生；④加强食品卫生安全监测，确保畜产品的安全消费。

参考文献

[1]田睿，徐思翔，谢烽，等.黄牛源产气荚膜梭菌分离株基因组的生物信息学分析[J/OL].畜牧兽医学报，1-13[2024-01-20].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1985.S.20231218.1555.002.html.

[2]周文惠，包红霞，王俊豪，等.甘草查尔酮A与三种抗生素联用对产气荚膜梭菌感染小鼠的治疗作用[J].畜牧兽医学报，2024，55（1）：334-345.

[3]扎西旺堆，王辰龙，柳泉，等.加查县3株藏猪源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性研究[J].甘肃畜牧兽医，2023，53（5）：89-92.

[4]耿梅，赵艳利，蒋红霞，等.规模化养鸡场A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其对海南霉素敏感性的测定[J].中国兽药杂志，2023，57（9）：14-19.

[5]张仕泓，王少林.动物源产气荚膜梭菌耐药性研究进展[J].畜牧兽医学报，2021，52（10）：2762-2771.

作者简介：王燕春（1975—），女，内蒙古赤峰人，本科，主任技师。研究方向：微生物检验，食品安全风险监测。