上调lncRNA MEG3对大鼠心肌细胞系缺氧/复氧损伤的影响

余敏，崔跃，黎鹏飞，谢丹，陈芬

摘要 目的：探究長链非编码RNA（lncRNA）母系表达基因3（MEG3）对大鼠心肌H9c2细胞缺氧/复氧（H/R）的保护作用及其与核因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）通路的关系。方法：将H9c2细胞分为Control组、H/R组、H/R＋Ad-绿色荧光蛋白（GFP）组、H/R＋Ad-MEG3组、H/R＋Ad-MEG3＋si-NC组及H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2组。实时荧光定量逆转录酶聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测MEG3表达；噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力；流式细胞仪检测细胞凋亡率；2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）法检测活性氧（ROS）水平；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性；蛋白质印迹（Western Blot）检测Nrf2/ARE通路相关蛋白表达。结果：与Control组比较，H/R组细胞凋亡率、细胞中ROS水平及Nrf2、血红素氧化酶1（HO-1）和醌氧化还原酶-1（NQO-1）蛋白水平均增高，而细胞活力、细胞中MEG3表达水平、SOD和CAT活性均降低（P＜0.05）。MEG3过表达可部分逆转H/R对H9c2细胞和Nrf2/ARE通路蛋白的影响（P＜0.05）；敲低Nrf2可削弱MEG3过表达对H/R损伤的保护作用（P＜0.05）。结论：MEG3过表达可抑制氧化应激和细胞凋亡减轻H/R心肌损伤，可能与激活Nrf2/ARE抗氧化信号有关。

关键词缺氧/复氧；长链非编码RNA母系表达基因3；心肌细胞H9c2；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.04.013

Effect of Up-regulated lncRNA MEG3 on Hypoxia/Reoxygenation Injury of Rats Myocardial Cell Lines

YU Min， CUI Yue， LI Pengfei， XIE Dan， CHEN Fen

Wuhan Red Cross Hospital， Wuhan 430015， Hubei， China， E-mail： yumin662@163.com

AbstractObjective：To explore the protective effect of maternal expression of long non-coding RNA（lncRNA） maternally expressed gene 3（MEG3） on hypoxia/reoxygenation（H/R） in rat myocardial H9c2 cells and its relationship with the nuclear factor E2 related factor 2（Nrf2）/antioxidant response element（ARE） pathway.Methods：H9c2 cells were divided into control group，H/R group，H/R＋Ad-Green fluorescent protein（GFP） group，H/R＋Ad-MEG3 group，H/R＋Ad-MEG3＋si-NC group and H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2 group.Real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-qPCR） was used to detect MEG3 expression.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） method was used to detect the viability of cells.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate.2′，7′-dichlorofluorescent yellow diacetate（DCFH-DA） method was used to detect the level of reactive oxygen species（ROS）.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect the activities of superoxide dismutase（SOD） and catalase（CAT）.Western Blot was used to detect the expression levels of Nrf2/ARE pathway related proteins.Results：Compared with the control group，the H9c2 cell apoptosis rate，cell ROS level and Nrf2，heme oxidase 1（HO-1） and quinone oxidoreductase-1（NQO-1） protein levels increased in the H/R group，while the cell viability，the MEG3 expression level in the cells，SOD and CAT activities reduced（P＜0.05）.MEG3 overexpression partially reversed the effects of H/R on H9c2 cells and Nrf2/ARE pathway proteins（P＜0.05）.Knockdown of Nrf2 could weaken the protective effect of MEG3 overexpression on H/R injury（P＜0.05）.Conclusion：Up-regulating the expression of MEG3 could inhibit oxidative stress and apoptosis to protect H/R myocardial Injury，which may be related to the activation of Nrf2/ARE antioxidant signals.

Keywordshypoxia/reoxygenation; long non-coding RNA maternally expressed gene 3; cardiomyocyte H9c2; experimental study

缺血性心脏病是由冠状动脉闭塞或狭窄引起的，冠状动脉血流恢复是减轻心肌缺血性损伤的有效干预措施［1］。但血流的恢复会诱发活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生和氧化损伤的恢复［2］。因此，防止氧化损伤是保护心脏免受心肌缺血/再灌注损伤的有效途径之一。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类不编码蛋白质的RNA，可参与各种疾病的发生发展［3］。母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）已被证明参与肿瘤、肺纤维化等多种疾病过程［4］。已有研究证实，MEG3可促进心肌缺血再灌注损伤的恢复［5］。然而其在心肌细胞缺血/再灌注损伤中的具体作用机制还未可知。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）通路在缺血/再灌注损伤中发挥着重要的作用［6］。本研究通过构建心肌H9c2细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，探讨MEG3在H/R心肌细胞中的作用及对Nrf2/ARE通路的影响，以期为进一步靶向治疗缺血/再灌注损伤提供依据。

1材料与方法

1.1实验材料

大鼠心肌H9c2细胞系（美国ATCC公司）；DEME培养基（上海联迈生物工程有限公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；总RNA提取试剂、实时荧光定量逆转录酶聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase linkage reaction，RT-qPCR）试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭（annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）凋亡检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（南京诺唯赞医疗科技有限公司）；反转录试剂盒（TaKaRa公司）；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、ROS检测试剂盒、放射免疫沉淀测定（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解缓冲液（Bestbio公司）；超氧化物歧化酶（superoside dismutase，SOD）酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）ELISA试剂盒（江西艾博因生物科技有限公司）；一抗：Nrf2、醌氧化还原酶-1（quinine oxidoreductase 1，NQO-1）、血红素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）及内参β-肌动蛋白（β-actin）（Abcam 公司）。

1.2方法

1.2.1细胞的分组及处理

将H9c2细胞分为Control组、H/R组、H/R＋Ad-绿色荧光蛋白（GFP）组、H/R＋Ad-MEG3组、H/R＋Ad-MEG3＋si-NC组及H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2组。Control组不做任何处理。H/R组构建H/R模型，即将H9c2细胞保存在无糖无血清的DEME培养基中，并在5%CO2、94%N2和1%O2的37 ℃培养箱中培养6 h，以模拟缺氧损伤［7］；后更换为正常培养基，并在5%CO2、95%空气的37 ℃潮湿培养箱中培养。在不同的时间点（12 h、24 h、48 h）收集细胞。H/R＋Ad-GFP组转染Ad-GFP后进行H/R处理；H/R＋Ad-MEG3组转染Ad-MEG3后进行H/R处理；H/R＋Ad-MEG3＋si-NC组转染Ad-MEG3和si-NC后进行H/R处理；H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2组转染Ad-MEG3和si-Nrf2后进行H/R处理。

1.2.2RT-qPCR检测MEG3表达

TRIZOL法提取总RNA，反转录形成cDNA，并进行RT-qPCR检测。以GAPDH为内参，2－ΔΔCt计算MEG3的相对表达。引物序列如下：MEG3正向为5′-TCGCTCTTCTCCATCGAACCG-3′，反向为5′-GTAGGGCGACGACTTTGAGT-3′；GAPDH正向为5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，反向为5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.2.3MTT法测定细胞活力

将细胞接种在96孔板中（1×104个/孔），24 h后添加20 mL MTT（0.5 g/L）孵育1 h，添加二甲基亚砜。检测各孔细胞在490 nm处的吸光度，Control组的吸光度设置为100%。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率

500 mL Annexin V结合缓冲液悬浮细胞，添加Annexin V-FITC和PI孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.52′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）法检测细胞内ROS水平

PBS洗涤细胞后添加10 mmol/L的DCFH-DA孵育30 min，酶标仪检测DCF荧光（488 nm激发波长和525 nm发射波长）。

1.2.6ELISA检测细胞内SOD和CAT活性

RIPA裂解液制备细胞裂解物，BCA法测定蛋白浓度，分别使用SOD和CAT ELISA试剂盒检测其活性。

1.2.7蛋白质印迹法（Western Blot）检测细胞内Nrf2/ARE通路相关蛋白表达

使用RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白后转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脱脂奶粉孵育1 h后，加一抗Nrf2、NQO-1、HO-1及β-actin在4 ℃下过夜孵育，隔日添加二抗孵育2 h后增强型化学发光（ECL）液显影，在凝胶成像仪中使条带可视化，通过Image-J软件分析条带的吸光度值。

1.3统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行数据分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析和SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1H/R后H9c2细胞中MEG3表达水平

与Control组比较，H/R组MEG3表达水平随着再复氧时间的增加而降低，故后续选择复氧的时间均为48 h（P＜0.05）。详见图1。

2.2不同处理对H/R诱导的H9c2细胞中MEG3表达、细胞活力、细胞凋亡率的影响

与Control组比较，H/R组细胞MEG3表达水平与细胞活力降低，细胞凋亡率均增高（P＜0.05）；与H/R＋Ad-GFP组比较，H/R＋Ad-MEG3组H9c2细胞MEG3表达水平与细胞活力增高，细胞凋亡率均降低（P＜0.05）；与H/R＋Ad-MEG3＋si-NC组比较，H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2组细胞MEG3表达水平与细胞活力降低，细胞凋亡率增高（P＜0.05）。详见图2、图3。

2.3不同处理对H/R诱导的H9c2细胞中氧化应激反应的影响

与Control组比较，H/R组细胞ROS水平增高，SOD和CAT活性降低（P＜0.05）；与H/R＋Ad-GFP组比较，H/R＋Ad-MEG3组细胞ROS水平降低，SOD和CAT活性增高（P＜0.05）；与H/R＋Ad-MEG3＋si-NC组比较，H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2组H9c2细胞ROS水平增高，SOD和CAT活性降低（P＜0.05）。详见图4。

2.4不同处理对H/R诱导的H9c2细胞中Nrf2/ARE通路的影响

与Control组比较，H/R组H9c2细胞中Nrf2、HO-1及NQO-1蛋白表达水平均增高（P＜0.05）；与H/R＋Ad-GFP组比较，H/R＋Ad-MEG3组H9c2细胞中Nrf2、HO-1及NQO-1蛋白表达水平均增高（P＜0.05）；与H/R＋Ad-MEG3＋si-NC组比较，H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2组H9c2细胞中Nrf2、HO-1及NQO-1蛋白表达水平均降低（P＜0.05）。详见图5、图6。

3讨论

ROS是缺血再灌注损伤中的信号介质［8］。血流的快速恢复增加了组织氧合水平，并导致第2次ROS生成爆发，通过诱导氧化应激和细胞凋亡导致组织再灌注损伤［2］。地黄多糖通过提高细胞活力和抗氧化酶SOD、CAT等的活性，降低细胞凋亡率和氧化应激损伤，从而对H/R损伤的心肌细胞发挥保护作用［9］。MEG3是一种抑癌因子，研究显示，MEG3在肝细胞和组织中下调，可通过调控miR-34a/Nrf2信号通路保护肝细胞免受H/R损伤［10］。本研究结果显示，MEG3过表达通过提高抗氧化酶SOD和CAT的活性，抑制氧化应激，保护H9c2细胞。然而，研究显示，MEG3通过抑制miR-7-5p表达促进心肌缺血再灌注损伤［5］，与本研究结果不同，这种差异可能与H/R造模方式不同、采用检测的平台不同、细胞微环境或实验操作方法的不同有关。因此，有必要对MEG3的作用机制进行深入探究。

ROS可影响包括Nrf2/ARE在内的多种信号通路［11］，Nrf2/ARE处于氧化应激的中心地位。减少ROS的产生和调节Nrf2/ARE通路可能是减少与缺血再灌注相关的组织损伤的新治疗策略。研究表明，Nrf2/ARE信号通路在保护心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用，并可作为治疗靶点［6-7］。Nrf2是细胞抗氧化反应的关键调节因子，通过两方面发挥氧化应激作用，1）通过加速Nrf2 mRNA转录增加蛋白合成；2）从细胞质中释放出来，转移到细胞核，与基因启动子区域的ARE结合，包括HO-1和NQO-1，参与氧化还原调节［12］。淫羊藿苷调节Nrf2/HO-1通路抑制H/R心肌细胞损伤［13］。本研究结果显示，上调MEG3表达增加了H/R刺激的H9c2细胞中Nrf2、HO-1及NQO-1表达水平，下调Nrf2表达可部分逆转MEG3过表达对H/R心肌细胞和Nrf2/ARE的影响，推测MEG3过表达激活Nrf2/ARE通路保护H/R心肌细胞。

综上所述，MEG3过表达通过抑制氧化应激和细胞凋亡保护H/R心肌损伤，可能与激活Nrf2/ARE抗氧化信号有关。但本研究未在动物模型和其他细胞系中验证MEG3功能，且并未深入探究MEG3如何调控Nrf2/ARE通路。后续将针对以上不足进一步完善研究。

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（收稿日期：2022-06-22）

（本文编辑邹丽）