三黄一龙汤对佐剂性关节炎继发心血管病变大鼠血管紧张素Ⅱ、醛固酮及相关炎性因子的影响

刘德芳，晏姣，郭明阳，李莞，罗勇，刘涛，杨敏，张耀雷

摘要 目的：探讨三黄一龙汤对佐剂性关节炎大鼠心脏的病理组织学、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）效应因子血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）和炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）表达的影响，探讨三黄一龙汤对佐剂性关节炎大鼠继发心血管病变的干预作用及调节机制。方法：70只Wistar健康雌性大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、阳性药物组、三黄一龙汤低剂量组、三黄一龙汤中剂量组、三黄一龙汤高剂量组和安慰剂组，每组10只。除正常组，其余各组大鼠建立佐剂性关节炎模型。三黄一龙汤低剂量组、三黄一龙汤中剂量组、三黄一龙汤高剂量组分别给予每日生药量19.8、39.6、79.2 g/kg灌胃，阳性药物组给予来氟米特2.1 mg/kg灌胃，安慰剂组灌胃等量生理盐水，连续干预4周。苏木精-伊红（HE）染色观察心脏的病理组织学变化，酶联免疫吸附测定法、蛋白印迹法和免疫组化法检测外周血和心脏组织AngⅡ、ALD、TNF-α和IL-6的变化。结果：病理结果显示，相对于正常组，模型组继发心肌损伤，主要表现为心肌组织发生局部炎症，局部心肌细胞排列紊乱，个别大鼠心肌有轻微间质水肿。方药三黄一龙汤能够显著改善心肌损伤，使其炎症病灶缩小，水肿程度减轻，下调心脏组织AngⅡ和ALD的表达（P＜0.05），降低外周血和心脏组织TNF-α、IL-6水平（P＜0.05）。结论：方药三黄一龙汤可能通过抑制RAAS中AngⅡ和ALD的表达，减少TNF-α、IL-6的产生，从而缓解佐剂性关节炎继发的心血管病变。

关键词心血管病变；三黄一龙汤；佐剂性关节炎；肾素-血管紧张素-醛固酮系统，RAAS；肿瘤坏死因子-α

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.04.008

Effect of Sanhuang Yilong Formula on Angiotensin Ⅱ， Aldosterone and Related Inflammatory Factors in Rats with Cardiovascular Disease Secondary to Adjuvant Arthritis

LIU Defang， YAN Jiao， GUO Mingyang， LI Wan， LUO Yong， LIU Tao， YANG Min， ZHANG Yaolei

General Hospital of Western Theater Command， Chengdu 610073， Sichuan， China

Corresponding AuthorZHANG Yaolei， E-mail： 1449359682@qq.com

AbstractObjective：To investigate the effects of Sanhuang Yilong Formula on heart tissue，renin-angiotensin-aldosterone system（RAAS） and aldosterone（ALD） and inflammatory factors tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-6（IL-6）in the heart of rats with adjuvant arthritis.To explore the intervention effect on secondary cardiovascular disease in adjuvant arthritis rats.Methods：A total of 70 Wistar healthy female rats were randomly divided into normal group，model group，positive drug group，Sanhuang Yilong Formula low-dose group，Sanhuang Yilong Formula medium-dose group，Sanhuang Yilong Formula high-dose group and placebo group，with 10 rats in each group.In addition to the normal group，the other groups of rats constructed  adjuvant arthritis model.Sanhuang Yilong Formula low-dose group，Sanhuang Yilong Formula medium-dose group，Sanhuang Yilong Formula high-dose group were given daily dose of 19.8，39.6 and 79.2 g/kg by gavage，respectively;positive drug group was given leflunomide 2.1 mg/kg by gavage;placebo group was given the equal volume of normal saline by gavage，and the intervention lasted for 4 weeks.Hematoxylin-eosin（HE） was used to observe the histopathological changes of the heart.The changes of AngⅡ，ALD，TNF-α，and IL-6 in peripheral blood and heart tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay，Western Blot and immunohistochemistry.Results：The pathological results showed that compared with the normal group，the model group showed secondary myocardial injury，which was mainly manifested as local inflammation of myocardial tissue，disordered arrangement of local cardiomyocytes，and slight interstitial edema of individual myocardium.Sanhuang Yilong Formula could significantly improve myocardial injury，attenuate inflammatory lesions，reduce edema degree，down-regulated the expression of AngⅡ and ALD in heart tissue（P＜0.05），and decreased the levels of TNF-α and IL-6 in peripheral blood and heart tissue（P＜0.05）.Conclusion：Sanhuang Yilong Formula may alleviate secondary cardiovascular diseases after adjuvant arthritis by inhibiting the expression of Ang-Ⅱ and ALD in the RAAS and attenuating IL-6 and TNF-α production.

Keywordscardiovascular disease; Sanhuang Yilong Formula; adjuvant arthritis; renin-angiotensin-aldosterone system， RAAS; tumor necrosis factor-α

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种致残率高并累及多系统、多器官的慢性炎症性风湿免疫疾病，RA病人心血管疾病（CVD）发病率和死亡率显著增加，超过50%的过早死亡归因于CVD［1］。RA病人心力衰竭发生率是普通人群的2倍，且随着年龄的增加心力衰竭发生率呈增加趋势，女性RA病人心力衰竭发生率甚至高出普通人群5倍［2］。RA病人心力衰竭的发病机制包括缺血性心脏病（IHD）、炎症介质、抗风湿药物治疗和淀粉样变性［3］，但导致CVD的主要原因尚未明确，故早期防治CVD显得尤为重要。CVD与肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）密切相关［4］。三黄一龙汤在临床应用10余年，具有苦寒燥湿、通络止痛之功效，可降低RA病人炎性指标红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）和细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-1、IL-17、干扰素-γ（IFN-γ）表达水平，改善RA病人临床症状和体征［5-6］。本研究通过构建佐剂性关节炎大鼠模型，探讨RA心血管病变情况以及三黄一龙汤防治其心血管病变的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物

6周龄无特定病原体（SPF）级雌性Wistar大鼠70只，体质量150～180 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（川）2015-030。温度22～25 ℃，湿度60%，自由摄食、饮水。实验方案经中国人民解放军西部战区总医院动物实验伦理委员会审批，伦理审批号：2022EC1-005。

1.2实验药物

三黄一龙汤药物组成：黄芩15 g，黄连15 g，黄柏15 g，茯苓30 g，威灵仙30 g，秦艽30 g，地龙15 g，白芍30 g，细辛5 g，生甘草5 g，低、中、高剂量分别配制成浓度为0.99 g/mL、1.98 g/mL、3.96 g/mL的溶液，由中国人民解放军西部战区总医院提供。来氟米特片，福建汇天生物药业有限公司生产，批号191209，规格为每片10 mg，溶于蒸馏水，制成0.1 g/mL溶液。

1.3主要试剂与仪器

大鼠IL-6酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（中国ExCell Bio公司，批号22J224），IL-6抗体（美国Genetex公司，批号GTX110527），大鼠TNF-α ELISA试剂盒（中国ExCell Bio公司，批号22J157），TNF-α抗体（美国Genetex公司，批号GTX110520），大鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）ELISA试剂盒（中国elabscience公司，批号HRIWM8ND2T），AngⅡ抗体（中国三鹰公司，批号18302-1-AP），大鼠醛固酮（aldosterone，ALD）ELISA试剂盒（中国elabscience公司，批号6531AFU4HT），ALD抗体（中国三鹰公司，批号11159-1-AP），二氨基联苯胺（DAB）（中国博奥森，批号C-0010），羊抗兔二抗（中国博奥森公司，批号bs-0295G），全蛋白提取试剂盒（中国凯基生物公司，批号KGP2100），二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（中国凯基生物公司，批号KGPBCA），弗氏完全佐剂（美国Sigma公司，批号F5881）。电动匀浆器（天根）；超低温冰箱（MDF-U53V，日本松下）；酶标仪（普朗）；凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）；台式低温高速离心机（Thermo ST16R，美国热电）；普通光学显微镜（Leica，DM3000，德国）。

1.4分组、造模与给药

将70只大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、阳性药物组、三黄一龙汤低剂量组、三黄一龙汤中剂量组、三黄一龙汤高剂量组和安慰剂组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠参考文献［7］建立佐剂性关节炎大鼠模型，将大鼠直接置于大鼠固定器上，暴露双侧后足趾，消毒后皮下注射弗氏佐剂0.15 mg/kg，3周后加强免疫，大鼠关节出现肿胀、溃烂及行动迟缓表明模型成功。按成人体质量的每日生药量190 g/60 kg浓度，三黄一龙汤低剂量组、三黄一龙汤中剂量组、三黄一龙汤高剂量组分别给予每日生药量19.8、39.6、79.2 g/kg灌胃，阳性药物组给予来氟米特2.1 mg/kg灌胃，安慰剂组灌胃等量生理盐水，连续干预4周。正常组与模型组不做任何处理。

1.5血清TNF-α、IL-6水平检测

腹腔注射4%水合氯醛1 mL/100 g麻醉大鼠，暴露腹主动脉，一次性采血针采血，真空采血管收集，室温凝固2 h，4 000 r/min离心20 min，分离血清作为待测样本。采用ELISA试剂盒检测血清TNF-α、IL-6水平。

1.6心脏组织TNF-α、IL-6、AngⅡ和ALD蛋白表达检测

参考文献［8］的心脏取材方式，应用4%水合氯醛1 mL/100 g麻醉大鼠，2 mL空气栓塞致死，迅速取下心脏，于生理盐水（含肝素）中洗去血液，至冻存管中保存于－80 ℃。采用蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测各蛋白表达变化。首先，利用蛋白提取试剂盒提取组织总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，定量后的蛋白加入loading buffer沸水浴10 min。配制10%分离胶和5%浓缩胶。应用10 μg总蛋白进行上样，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），浓缩胶在恒压80 V、分离胶在恒压120 V条件下进行电脉，300 mA恒流转聚偏二氟乙烯膜（PVDF）1.5 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗TNF-α和IL-6抗体，anti-AngⅡ和anti-ALD，4 ℃孵育过夜，Tris-HCl缓冲盐溶液（TBST）洗膜3次，每次5 min；羊抗兔二抗1∶4 000室温孵育40 min，TBST洗膜3次，每次5 min，加入显影液；通过凝胶成像系统曝光显影，并计算各组灰度值。

1.7苏木精-伊红（HE）染色观察心脏组织病理学变化

取出各组大鼠心脏，洗去多余血液后移入4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水，包埋于石蜡中，4 μm切片，烤片1 h，常规脱蜡复水，苏木素染色4 min，流水冲洗1 min，1%盐酸乙醇分化2次，每次5 s，流水冲洗返蓝10 min，伊红染色5 s，流水迅速冲洗多余伊红，室温干燥后用中性树胶封片。于普通光学显微镜（DM3000，德国莱卡）100倍下观察各组心脏组织病理学变化。

1.8免疫组化法检测心脏组织中AngⅡ和ALD表达变化

取大鼠的心脏组织，采用免疫组化法检测。脱蜡复水前与HE染色步骤相同，脱蜡复水后于酸修复液中微波炉沸水浴5 min，自然冷却至室温，磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗3 min，移入3%H2O2中10 min，PBST洗3 min，山羊血清封闭20 min，加入一抗anti-AngⅡ和anti-ALD，4 ℃孵育过夜。将玻片置于PBST洗3次，每次3 min，加入生物素标记的山羊抗大鼠IgG聚合物，室温孵育20 min，PBST洗3次，每次3 min，加入辣根过氧化物酶标记链霉卵蛋白素，室温孵育20 min，PBST洗3次，每次3min，加入DAB显色液显色2 min，置于流水终止显色，玻片放入苏木素染色4 min，流水冲洗1 min，1%盐酸乙醇分化2次，每次5 s，流水冲洗返蓝10 min，室温干燥后用中性树胶封片。于普通光学显微镜（DM3000，德国莱卡）100倍下观察各组心脏病理变化，利用image pro plus测定各组阳性区域面积及光密度。

1.9统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行数据分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，若符合参数检验，组间比较采用one-way ANOVA，进一步两两比较采用LSD检验，若不符合，采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠心脏组织病理学变化

与正常组比较，模型组心脏组织发生局部炎症，局部心肌细胞排列紊乱，个别大鼠心肌有轻微间质水肿。与模型组比较，三黄一龙汤低、中、高剂量组均能改善心肌损伤，其中以中剂量更为显著，主要表现为炎症病灶更小，水肿程度更轻；安慰剂组心肌组织无显著变化。详见图1。

2.2各组大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6水平比较

与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，阳性药物组TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05）；三黄一龙汤低剂量组、三黄一龙汤中剂量组、三黄一龙汤高剂量组TNF-α、IL-6水平降低，其中以三黄一龙汤中剂量组、三黄一龙汤高剂量组更为显著（P＜0.05）。详见图2、图3。

2.3各组大鼠心脏组织TNF-α、IL-6蛋白表达比较

与正常组比较，模型组大鼠心脏组织TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，阳性药物组TNF-α、IL-6蛋白表达水平降低（P＜0.05）；三黄一龙汤低剂量组、三黄一龙汤中剂量组、三黄一龙汤高剂量组TNF-α、IL-6蛋白表达水平降低（P＜0.05），其中以三黄一龙汤高剂量组TNF-α蛋白表达水平降低最明显（P＜0.05）。详见图4～图6。

2.4各组大鼠心脏组织AngⅡ、ALD表达变化

与正常组比较，模型组大鼠心脏组织AngⅡ、ALD蛋白表达升高（P＜0.05）。与模型组比较，阳性药物组AngⅡ、ALD蛋白表达均降低（P＜0.05）；三黄一龙汤低剂量组、三黄一龙汤中剂量组、三黄一龙汤高剂量组AngⅡ、ALD蛋白表达均降低（P＜0.05），其中三黄一龙汤中、低剂量组AngⅡ、ALD蛋白表达降低最明显（P＜0.05）。详见图7～图10。

3讨论

RA病人患CVD的风险主要在于高水平炎症相关特异性因子，其中TNF-α通过核因子-κB（NF-κB）通路参与RA伴发CVD的血管慢性炎症病程，IL-6是动脉粥样硬化斑块形成的重要参与者［9］。RA病人的炎症活动期，左心室舒张功能受损，左心室相对壁厚指数增大［10］，增加了心力衰竭风险［11-12］。RA与不稳定动脉粥样硬化斑块具有相同的炎症机制，TNF-α和IL-6表达升高，而抗风湿药甲氨蝶呤、TNF-α抑制剂和IL-6受体拮抗剂可降低CVD风险［13］，其中IL-6受体拮抗剂可降低N末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）水平，改善血管内皮功能和左心室射血分数及临床症状［14-15］。胶原诱导关节炎大鼠的心房颤动诱导率和持续时间显著增加，且心房颤动持续时间与TNF-α和IL-6水平呈正相关［16］。因此，控制RA的疾病活动对防治其临床心脏病的进展非常重要。

研究表明，三黄一龙汤可通过抑制TNF-α、IL-6、IL-17等表达而控制RA疾病活动度，改善其临床症状［5-6］。三黄一龙汤以黄芩、黄连、黄柏3味药为君药，黄芩的主要化学成分黄芩苷具有心脏保护作用，与调节其氧化应激与炎症相关［17-18］；黄连的主要成分黄连素可通过灌胃大鼠显著改善AngⅡ诱发的心肌纤维化，减轻其引发的心功能不全［19］；黄柏的主要成分黄柏碱可通过减少心肌细胞凋亡及抑制TNF-α、IL-1β表达而改善小鼠内毒素性心功能障碍［20］。因此，推测三黄一龙汤对RA继发的心血管疾病具有保护作用。但其作用机制有待进一步探讨。

本研究中，通过HE染色观察了佐剂性关节炎大鼠心脏组织病理组织学变化，主要表现为心脏组织发生局部炎症，局部心肌细胞排列紊乱，个别大鼠心肌有轻微间质水肿。采用ELISA和Western Blot检测了佐剂性关节炎大鼠外周血及心脏组织TNF-α、IL-6水平，表现出TNF-α、IL-6表达上调；通过Western Blot和免疫组化法检测了AngⅡ和ALD，结果显示，AngⅡ、ALD表达显著上调。本实验结果表明佐剂性关节炎可激活RAAS导致AngⅡ、ALD表达上调，促进炎性因子TNF-α、IL-6产生，进而诱发心血管损伤。

本研究还观察了三黄一龙汤对佐剂性关节炎大鼠心脏组织病理组织学及外周血和心脏组织TNF-α、IL-6、AngⅡ及ALD表达的影响，病理学表现出三黄一龙汤低、中、高剂量组均能改善心肌损伤，其中以中剂量更为显著，主要表现为炎症病灶更小，水肿程度更轻；三黄一龙汤不同剂量均可不同程度地降低外周血和心脏组织中TNF-α、IL-6水平，并能降低心脏组织中AngⅡ、ALD蛋白表达水平。表明三黄一龙汤对佐剂性关节炎诱发的心脏损伤具有保护作用，可能通过抑制佐剂性关节炎系统AngⅡ、ALD的激活减少炎性因子TNF-α、IL-6的产生而改善佐剂性关节炎继发心血管损伤。

综上所述，本研究证实了三黄一龙汤可能通过抑制AngⅡ、ALD表达而减少炎性因子的产生，从而缓解RA继发心脏损伤，但其具体机制和主要有效活性成分还需要进一步研究阐明。

参考文献：

［1］LAZZERINI P E，CAPECCHI P L，LAGHI-PASINI F.Systemic inflammation and arrhythmic risk：lessons from rheumatoid arthritis［J］.European Heart Journal，2017，38（22）：1717-1727.

［2］KANG E H，LIAO K P，KIM S C.Cardiovascular safety of biologics and JAK inhibitors in patients with rheumatoid arthritis［J］.Current Rheumatology Reports，2018，20（7）：42.

［3］ZHANG M，WANG M M，TAI Y，et al.Triggers of cardiovascular diseases in rheumatoid arthritis［J］.Current Problems in Cardiology，2022，47（6）：100853.

［4］UPPAL S S，HAIDER M Z，HAYAT S J，et al.Significant association of insertion/deletion polymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene with rheumatoid arthritis［J］.The Journal of Rheumatology，2007，34（12）：2395-2399.

［5］刘德芳，罗勇，晏姣，等.三黄一龙汤联合MTX对类风湿关节炎湿热痹阻型患者血清白细胞介素-1、6、17表达的影响［J］.中国中西医结合杂志，2015，35（1）：33-36.

［6］LIU D F，YAN J，YUN M D，et al.Effect of Sanhuangyilong Decoction plus methotrexate on tumor necrosis factor alpha and interferon gamma in serum and synovial fluid in rheumatoid arthritis patients with symptom pattern of damp heat obstruction［J］.Journal of Traditional Chinese Medicine，2016，36（5）：625-633.

［7］GOU K J，ZENG R，REN X D，et al.Anti-rheumatoid arthritis effects in adjuvant-induced arthritis in rats and molecular docking studies of Polygonum orientale L.extracts［J］.Immunology Letters，2018，201（11）：59-69.

［8］WANG Q，ZHANG Y R，LI D，et al.Transgenic overexpression of transient receptor potential vanilloid subtype 1 attenuates isoproterenol-induced myocardial fibrosis in mice［J］.International Journal of Molecular Medicine，2016，38（2）：601-609.

［9］张贤政，张玲玲，魏伟.炎性因子及脂肪因子参与类风湿关节炎并发心血管疾病的研究进展［J］.医药导报，2017，36（11）：1283-1287.

［10］MIDTB H，GERDTS E，KVIEN T K，et al.Disease activity and left ventricular structure in patients with rheumatoid arthritis［J］.Rheumatology，2015，54（3）：511-519.

［11］MARADIT-KREMERS H，NICOLA P J，CROWSON C S，et al.Raised erythrocyte sedimentation rate signals heart failure in patients with rheumatoid arthritis［J］.Annals of the Rheumatic Diseases，2007，66（1）：76-80.

［12］AHLERS M J，LOWERY B D，FARBER-EGER E，et al.Heart failure risk associated with rheumatoid arthritis-related chronic inflammation［J］.Journal of the American Heart Association，2020，9（10）：e014661.

［13］KEROLA A M，ROLLEFSTAD S，SEMB A G.Atherosclerotic cardiovascular disease in rheumatoid arthritis：impact of inflammation and antirheumatic treatment［J］.European Cardiology，2021，16：e18.

［14］MARTYNOVA A，POPKOVA T，GERASIMOVA H.ab0308 no signs of congestive heart disease progression in patients with rheumatoid arthritis on IL-6 receptor antagonist after 12 months treatment［J］.Annals of the Rheumatic Diseases，2020，79（Suppl 1）：1452-1453.

［15］IKONOMIDIS I，TZORTZIS S，ANDREADOU I，et al.Increased benefit of interleukin-1 inhibition on vascular function，myocardial deformation，and twisting in patients with coronary artery disease and coexisting rheumatoid arthritis［J］.Circulation Cardiovascular Imaging，2014，7（4）：619-628.

［16］DAI H，WANG X Y，YIN S L，et al.Atrial fibrillation promotion in a rat model of rheumatoid arthritis［J］.Journal of the American Heart Association，2017，6（12）：e007320.

［17］刘萍，唐代，王旭，等.黄芩苷对心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制［J］.中医药学报，2021，49（2）：16-21.

［18］李亚芹，徐占稳，赵兴洲，等.黄芩茎叶总黄酮灌胃对原发性高血压大鼠心肌重构及心肌组织NF-κB表达的影响［J］.山东医药，2022，62（5）：39-42.

［19］姜学泽，陈宇涵，陈友铭，等.黄连素下调细胞周期蛋白依赖性激酶-2活性抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化［J］.同济大学学报（医学版），2020，41（6）：691-699.

［20］孙红玲，吴娇.小檗碱的药理作用研究进展［J］.新乡医学院学报，2020，37（1）：91-95.

（收稿日期：2022-06-26）

（本文编辑邹丽）