UPLC-MS/MS测定心悦胶囊中6个皂苷类成分的含量△

2024-04-29赵振霞王晓蕾耿韫朱靖于新兰刘永利

中国现代中药 2024年3期

赵振霞，王晓蕾，耿韫，朱靖，2，于新兰，刘永利*

1.河北省药品医疗器械检验研究院河北省中药质量评价与标准研究重点实验室，河北石家庄 050227；2.河北医科大学，河北石家庄 050017；3.新疆维吾尔自治区药品检验研究院，新疆乌鲁木齐 830004

心悦胶囊是由西洋参茎叶总皂苷制成的单方制剂，具有益气养心、和血之功效，多用于治疗气阴两虚、瘀血阻络引起的冠心病、心绞痛[1]。此外，尚有心悦胶囊治疗冠心病慢性充血性心衰、慢性心功能不全的临床报道[2-3]。西洋参茎叶总皂苷是从西洋参茎叶中提取的总皂苷，可补气养阴、和血[4]。西洋参茎叶含有以人参皂苷为主的多种活性成分[5-7]，《中华人民共和国药典》2020 年版中仅对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re 与人参皂苷Rb3进行了含量测定，人参皂苷Rg1与人参皂苷Re为五加科植物的共有成分[8-9]，人参皂苷Rb3也非西洋参茎叶的特征性成分[10-12]，不能全面有效地控制该品种的内在质量。

超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS/MS）以其专属性强、简便快捷等优势在中成药测定中被广泛应用[13-15]。因此，参考相关文献[16-17]，采用UPLC-MS/MS 建立心悦胶囊中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rd和20(S)-人参皂苷F1的含量测定方法，不仅对共有的皂苷类成分进行了测定，还对西洋参茎叶的专属性成分拟人参皂苷F11与20(S)-人参皂苷F1进行了测定，提高了方法的专属性，可为心悦胶囊的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Acquity UPLC/XEVO TQ-S 型超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国Waters 公司）；AE240型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Mili-Q型超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

对照品人参皂苷Rg1（批号：110703-201530，纯度：91.7%）、人参皂苷Re（批号：110754-201525，纯度：92.3%）、人参皂苷Rb1（批号：110704-201424，纯度：93.7%）、拟人参皂苷F11（批号：110841-201406，纯度：100.0%）、人参皂苷Rd（批号：111818-201302，纯度：94.2%）均购自中国食品药品检定研究院；20(S)-人参皂苷F1（南通飞宇生物科技有限公司，批号：FY15401226，纯度：100.0%）；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为超纯水。

样品心悦胶囊购自药店（批号分别为2107591、180601、180604）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-水（B）为流动相梯度洗脱（0～2.00 min，20%～50%A；2.00～2.01 min，50%～80%A；2.01～3.00 min，80%A）；柱温：40 ℃；流速：0.5 mL·min-1；进样量：5 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），负离子扫描，多反应监测（MRM）模式，毛细管电压：3.0 kV；锥孔电压：20 V；脱溶剂气温度：500 ℃，质谱参数见表1。

表1 心悦胶囊中6个皂苷类成分质谱分析

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备对照品储备液：精密称取对照品人参皂苷Rg110.51 mg、人参皂苷Re 10.66 mg、人参皂苷Rb110.62 mg、拟人参皂苷F1110.54 mg、人参皂苷Rd 10.20 mg、20(S)-人参皂苷F19.81 mg置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，再分别精密吸取上述溶液各2 mL，置同一100 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，得到人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rd、20(S)-人参皂苷F1质量浓度分别为1.928、1.968、1.990、2.108、1.922、1.962 μg·mL-1的对照品储备液。

系列对照品溶液：分别精密量取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd对照品储备液0.5、1.0、2.5、5.0、40.0、50.0 mL 置100 mL量瓶中，以20%乙腈水溶液稀释并定容至刻度，人参皂苷Rg1质量浓度分别为9.638、19.280、48.190、96.380、771.000、963.800 ng·mL-1，人参皂苷Re质量浓度分别为9.839、19.680、49.200、98.390、787.100、983.900 ng·mL-1，人参皂苷Rb1质量浓度分别为9.951、19.900、49.750、99.510、796.100、995.100 ng·mL-1，人参皂苷Rd 质量浓度分别为9.608、19.220、48.040、96.080、768.700、960.800 ng·mL-1的系列混合对照品溶液；分别精密量取拟人参皂苷F11、20(S)-人参皂苷F1对照品储备液0.25、1.00、2.50、5.00、40.00、50.00 mL置100 mL 量瓶中，以20% 乙腈水溶液稀释并定容至刻度，拟人参皂苷F11质量浓度分别为5.270、21.080、52.700、105.400、843.200、1 054.000 ng·mL-1，20(S)-人参皂苷F1质量浓度分别为4.905、19.620、49.050、98.100、784.800、981.000 ng·mL-1的系列混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备取本品10 粒的内容物（平均每粒质量为0.3 mg），研细，取约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定质量，置水浴中加热回流75 min，取出，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置100 mL量瓶中，加20%乙腈水溶液稀释并定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验精密量取2.3 项下的对照品溶液和供试品溶液适量，按2.1项下色谱条件和2.2项下质谱条件进样分析。结果各成分峰形良好，相互之间互不干扰，专属性较好（图1）。

图1 心悦胶囊中6个皂苷类成分定量、定性离子二级质谱图

2.4.2 线性关系考察分别精密吸取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rd、20(S)-人参皂苷F1溶液5 μL，注入超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，测定，以对照品进样质量浓度为横坐标（X）、峰面积积分值为纵坐标（Y），进行线性回归，结果见表2，表明各成分在各自线性范围内线性关系良好。

表2 心悦胶囊中6个皂苷类成分线性关系

2.4.3 精密度试验取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rd 和20(S)-人参皂苷F1质量浓度分别为48.19、49.20、49.75、52.70、48.04、49.05 ng·mL-1的混合对照品溶液，重复进样6 次，各成分峰面积的RSD 分别为2.5%、3.7%、3.1%、3.5%、1.9%、3.1%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验取同一供试品溶液（批号：2107591），室温放置，分别于0、1、4、8、15、24 h 分别进样测定。结果各成分峰面积的RSD 分别为3.5%、2.0%、4.6%、2.6%、3.6%、3.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验取同一批样品（批号：2107591），研细，取0.125、0.250、0.375 g各3份，精密称定，按2.3.2 项下方法分别制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件和2.2 项下质谱条件进样测定，记录各成分峰面积积分值，计算含量及其RSD，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rd 和20(S)-人参皂苷F1质量分数分别为2.590、14.720、1.880、13.770、15.810、0.430 mg·g-1，含量的RSD 分别为3.1%、3.3%、3.9%、3.8%、2.1%、4.1%，表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验取已知含量的样品（批号：2107591）9 份，每份约 0.125 g，精密称定，分别加入用80%甲醇配制的低、中、高3个质量浓度的混合对照品溶液25 mL，按2.3.2项下方法分别制备供试溶液，进样测定，计算回收率，结果见表3，表明本方法回收率较好。

表3 心悦胶囊6个皂苷类成分加样回收率试验结果

2.5 样品测定

采用所建立的方法测定3批心悦胶囊样品中6个皂苷类成分的含量，结果见表4。

表4 心悦胶囊6个皂苷类成分含量测定结果mg/粒

3 讨论

3.1 检测方法的选择

人参皂苷Rg1与人参皂苷Re 分离困难，用常规液相色谱方法实现分离分析时间较长，且难以检测到一些含量较低的成分，UPLC-MS/MS 表现出的高选择性、高灵敏度，大大缩短了分析时间。另外，人参皂苷类成分没有生色团，采用紫外检测器时只能在末端吸收处进行测定，干扰多，且其特征性成分拟人参皂苷F11无紫外吸收。因此选择了质谱检测器，以MRM 模式进行测定，专属性强、重复性好，可准确测定样品中皂苷类成分的含量，有效地提高药品质量控制水平。

3.2 质谱条件的选择

在质谱条件的选择中，为使各成分准分子离子峰信号达到最强，分别用6个成分1 μg·mL-1的对照品溶液，以正、负离子模式进行检测。之后对其进行二级质谱扫描，离子源为ESI，定量方式为MRM，通过能量优化来选择特征碎片离子，研究过程中发现其在负离子模式下基线平稳，具有较高的响应值和较好的峰形。因此，本研究选择负离子模式进行测定，最终确定了最佳质谱条件。