奇白消软膏的定性鉴别与定量检测

2024-04-29梁林辉章斌姚永秀彭东刘德军赵君

中国民族民间医药·上半月 2024年1期

梁林辉章斌姚永秀彭东刘德军赵君

【摘要】目的：建立奇白消软膏的定性鉴别与含量测定方法，加强奇白消软膏的质量控制。方法：采用薄层色谱（TLC）法对制剂中的黄连和人工牛黄进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）测定制剂中黄连有效成分盐酸小檗碱的含量。结果：奇白消软膏的TLC斑点清晰、阴性无干扰、分离度好；盐酸小檗碱在1.28～38.4 μg；回归方程为Y=49873.84X-554.74（r＝1）。精密度、稳定性、重复性试验的RSD分别为0.41%、0.38%、1.8%；加样回收率为98.88％～101.23％，RSD为0.95％（n＝6）。结论：本研究建立的TLC和HPLC简便易行，准确、重复性好，可用于奇白消软膏的质量控制。

【关键词】奇白消软膏；盐酸小檗碱；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量控制

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2024）01-0028-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.01.zgmzmjyyzz202401007

Research on TLC Indentification and Content Determination of Qibaixiao Ointment

LIANG Linhui1，2 ZHANG Bin1，2* YAO Yongxiu1，2 PENG Dong3 LIU Dejun1，2 ZHAO Jun4

1. School of Pharmacy and Medical Laboratory Science， Yaan Polytechnic College， Yaan， 625000， China;

2.Yaan Food and Drug Application Development Research Center， Yaan， 625000， China;

3.Yaan Puyuan Biotechnology Co.， Ltd， Yaan， 625000， China;

4. School of pharmacy， Chengdu Medical College， Chengdu， 610000， China

Abstract：Objective To establish the identification and content determination methods of Qibaixiao Ointment， to enhance the quality controllability of Qibaixiao Ointment. Methods Thin layer chromatography method（TLC）was used for qualitative identification of Coptis chinensis Franch， Bovis calculus Artifactus. Using high performance liquid chromatography （HPLC） was used for content determination of Berberine hydrochloride. Results The TLC spots were clear spots with less negative interference， well separated and good reproducibility. Berberine hydrochloride showed a good linear relationship in the range of 1.28-38.4 μg. The regression equation was： Y=49873.84X-554.74（r＝1）. The RSD values of precision， repeatability and stability experiments were 0.41%， 0.38%， 1.8%. The average recovery rates was 98.88%-101.23% with RSD was 0.95%（n=6）. Conclusion The qualitative identification method and content determination method established method in this study for Qibaixiao Ointment are easy to operate with good reproducibility and accurate， reliable. It can be used to evaluate the quality of Qibaixiao Ointment.

Keywords：Qibaixiao Ointment; Berberine Hydrochloride; TLC; HPLC; Quality Control

奇白消軟膏是由黄连、人工牛黄、冰片、琥珀、朱砂粉等6味中药组成，辅以凡士林适量，制成的软膏剂，具有解毒燥湿，杀虫止痒功效。其中，君药黄连清热燥湿，泻火解毒；人工牛黄清热解毒；佐以冰片、琥珀、朱砂，清热止痛、散瘀止血、安神解毒^［1］。临床常用于外阴白斑病，症见白斑带下、阴痒、皲裂，溃疡、增生或萎缩等^［2］。同时，奇白消软膏在治疗婴儿湿疹方面疗效显著^［3］。奇白消软膏临床使用多年，但未见有其质量标准研究。为加强制剂的质量控制，保证用药安全、有效，本文研究该制剂薄层鉴别和含量测定两项主要质量标准项目，为奇白消软膏质量标准的建立提供了参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Essentia LC-16高效液相色谱仪（日本岛津），AUW120D分析天平（日本島津），Symmetry-C18色谱柱（美国沃特世），Shim-pack VP-ODS色谱柱（日本岛津）。

1.2 药品与试剂奇白消软膏（批号：20210616-1、20210616-2，四川家传方中医药科技有限公司）；盐酸小檗碱对照品（批号：110713-20100，含量：86％，中国食品药品检定研究院）；黄连对照药材（批号：DZYC-H-004，成都瑞芬思生物科技有限公司）；牛胆粉（批号：KZTL-5E46，中国食品药品检定研究院）；色谱纯甲醇（批号：LOT 210841，赛默飞）、色谱纯乙腈（批号：210774，赛默飞）；纯化水为市售纯净水；其他试剂（分析纯）均为市售常规试剂。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 黄连的薄层鉴别取奇白消软膏3.0 g，加石油醚30 mL搅拌均匀，3000 r/min离心5 min，弃去上清夜，沉淀加25 mL甲醇超声处理30 min，3000 r/min离心5 min，上清液为供试品溶液；取除黄连药材外其他5味药材，按处方比例混合并与凡士林混合均匀，参照供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。取黄连对照药材0.25 g，加25 mL甲醇超声处理30 min，3000 r/min离心5 min，上清液作为对照药材溶液。取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液及对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙醇-冰乙酸-水（4∶1∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，365 nm下检视。供试品和对照药材色谱在相应的位置上显三个相同颜色的斑点，阴性对照无干扰（如图1a）。

按上述方法，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）为展开剂，把硅胶板置于浓氨饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，365 nm下检视。供试品和对照药材色谱在相应的位置上显五个相同颜色的斑点，供阴性对照无干扰（如图1b）。

2.1.2 人工牛黄的薄层鉴别取奇白消软膏3.0 g，加石油醚30 mL搅拌均匀，3000 r/min离心5 min，弃去上清夜，沉淀加25 mL甲醇超声处理30 min，3000 r/min离心5 min，上清液为供试品溶液；取除人工牛黄外其他5味药材，按处方比例混合并与凡士林混合均匀，参照供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。取牛胆粉对照品，加甲醇制成1.5 mg/mL的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液及对照品溶液各8 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇（20∶25∶2∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10磷钼酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品和对照品色谱在相应的位置上显相同的蓝色斑点，阴性对照无干扰（如图2）。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱方法适用性考察

2.2.1.1 色谱条件处方中黄连为君药，故选择黄连的有效成分盐酸小檗碱作为奇白消软膏含量测定指标。色谱柱： Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长为345 nm；流动相为乙腈：0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调节pH值至3.0）（30∶70）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。结果表明，样品中盐酸小檗碱峰分离好，峰形对称，并且阴性无干扰，该法专属性良好（如图3）。

2.2.1.2 对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.2.1.3 线性关系考察精密量取盐酸小檗碱对照品溶液适量，置10 mL容量瓶中，加甲醇摇匀，定容，制成质量浓度分别为1.5 μg/mL、3 μg/mL、9 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL、40 μg/mL的对照品溶液。按“2.2.1.1”项下色谱条件检测，以峰面积为纵坐标，对照品浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线如图4；盐酸小檗碱的回归方程、线性范围见表1。结果表明盐酸小檗碱的线性关系良好。

2.2.1.4 精密度试验参照“2.2.1.1”项下色谱条件，选取“2.2.1.3”项下浓度为25 μg/mL盐酸小檗碱对照品，连续进样6次，盐酸小檗碱的峰面积RSD为 0.41%，仪器精密度良好。

2.2.2 样品溶液的制备方法考察

2.2.2.1 制备方法试验取齐白消软膏（批号：20210616-1）12份，每份约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别以50%甲醇-盐酸（100∶1）、75%甲醇-盐酸（100∶1）、甲醇-盐酸（100∶1）、50%乙醇-盐酸（100∶1）、70%乙醇-盐酸（100∶1）、95%乙醇-盐酸（100∶1）混合溶液各50 mL为提取溶剂，平行1份，称定重量，超声处理30 min，取出，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。按“2.2.1.1”项下色谱条件进样，测定含量，结果见表3。由表3可知，95%乙醇对指标成分的提取含量较高。但考虑到齐白消软膏中凡士林对提取效果的影响，故进行追加实验，先除去凡士林，再考察甲醇和95%乙醇的提取效果。取本品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加20 mL石油醚（60～90），搅拌振摇，滤过，残渣精密加入甲醇-盐酸（100∶1）、95%乙醇-盐酸（100∶1）混合溶液50 mL，平行1份，称定重量。同法制成供试品溶液。结果表明，去除凡士林后，盐酸小檗碱含量明显提高，优选以甲醇-盐酸（100∶1）溶剂来制备样品。

2.2.2.2 供试品溶液的制备取本品适量，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加20 mL石油醚（60～90），搅拌振摇，滤过，残渣精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）混合溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-盐酸（100∶1）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.3 阴性对照溶液的制备取奇白消软膏（缺黄连）阴性对照，按照“2.2.2.2”项下方法制备得缺黄连的阴性对照溶液。

2.2.3 重复性试验取本品（批号：20210616-1）0.5 g，精密称定，共6份，按“2.2.2.2”项下方法制备；按“2.2.1.1”色谱条件下进样，测定峰面积，计算盐酸小檗碱的含量。结果见表4，盐酸小檗碱含量的RSD为1.80%，表明该方法的重现性较好。

2.2.4 稳定性试验取“2.2.3”项下1号供试品溶液，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h进样，记录盐酸小檗碱峰面积，计算RSD值。由表5可知，盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.38%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.5 加样回收率试验取已知含量的样品（批号：20210616-2）0.5 g，精密称定，共6份，计算得盐酸小檗碱含量为（3.1629 mg/g），分别精密加入盐酸小檗碱（0.2741 mg/mL）的对照品溶液5 mL，定容，按“2.2.2.2”项下方法制备，进样，测定峰面积，计算回收率。由表6可知，盐酸小檗碱平均加样回收率为99.93%，RSD值为0.95%，表明该方法的准确度较好。

2.2.6 样品含量测定取黄连药材、批次奇白消软膏（批号： 20210616-1、20210616-2）样品各1份，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并取“2.2.1.2”项下对照品溶液，按“2.2.1.1”项下色谱条件测定，计算指标成分的含量，结果见表7。处方中，黄连80 g，总量1000 g，转移率为63.51%，计算公式如下：

3 讨论

奇白消软膏是以大量凡士林为辅料制成的稠膏剂，对薄层鉴别及含量测定带来一定难度，本实验首先考虑的是去除凡士林而不影响检测结果。

冰片作为一种佐剂，在烧伤、止痛去痒等皮肤疾病中应用广泛^［4］，属单萜化合物，在乙醚、氯仿、石油醚等亲脂性溶剂中极易溶解，与凡士林溶解性相似。因此，在样品前处理的过程中易把冰片一并去除，故未对奇白消软膏中冰片进行薄层鉴别研究。

薄层鉴别中，本试验采用不同展开剂加以筛选优化。在黄连的薄层鉴别中，本文比较了2020版药典展开系统Ⅰ：环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）、展开系统Ⅱ：苯-乙酸乙酯-异浓丙醇-甲醇-浓氨（12∶6∶3∶3∶1）^［5］和自制的展开系统Ⅲ：正丁醇-乙醇-冰乙酸-水（4∶1∶2∶1）三种不同展开剂对色谱情况的影响，研究发现展开系统Ⅰ和Ⅲ分离良好，斑点分度更大，阴性无干扰，均可作为齐白消软膏中黄连的薄层鉴别展开系统。

2020版中国药典，人工牛黄中牛胆粉的鉴别使用的展开系统为甲苯-冰醋酸-水（7.5∶10∶0.3），赵萨茹拉^［6］在蒙药方剂古日古木-13中的西红花和人工牛黄的薄层色谱定性鉴别研究中，鉴别人工牛黄采用相同的展开系统。本试验尝试比较了甲苯-冰醋酸-水（7.5∶10∶0.3）、正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇（20∶25∶2∶3）和石油醚-乙酸乙酯-甲酸（2∶10∶0.2）三种不同展开系统对色谱情况的影响，发现三种展开系统均可分离，在展开系统甲苯-冰醋酸-水（7.5∶10∶0.3）为展开剂中展开，样品斑点和对照品斑点不在同一条直线上，原因可能是黄连的干扰。正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇（20∶25∶2∶3）中展开，斑点分离的好、清晰，比移值合适，优选该系统作为齐白消软膏中人工牛黄的薄层鉴别展开系统。

黄连中盐酸小檗碱含量测定采用药典方法并适当优化，检测波长为345 nm；调整流动相为乙腈：0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调节pH值至3.0）比例为30∶70。结果表明，样品中各峰分离完全，盐酸小檗碱峰形对称，阴性无干扰，该法专属性良好。

综上所述，本研究所建立的方法简便易行、准确、重复性好，为奇白消软膏的质量控制和质量标准的建立提供了科学依据，为进一步制剂开发和临床应用奠定了药学基础。

参考文献

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京：中国医药科技出版社，2020：5，143，152，316.

［2］余金丽，梁翠芬.祛湿消白散及奇白消软膏治疗外阴白色病变的疗效观察［J］.中国医药指南，2014，12（33）：262-263.

［3］张银珍.奇白消软膏治疗婴儿湿疹1840例临床观察［J］.中国社区医师2013，15（1）：211-211.

［4］查英，官玲亮，白琳，等.天然冰片研究进展［J］.热带农业科学，2019，39（3）：97-104.

［5］郭时金，邓旭明，沈志强.清瘟败毒颗粒中黄连和连翘的薄层鉴别［J］.家畜生态学报，2012，33（5）：68-70.

［6］赵萨茹拉，包庆格乐吐，贺喜格达来，等.蒙药方剂古日古木-13中的西红花和人工牛黄的薄层色谱定性鉴别［J］.北方药学，2016，13（10）：11.

（收稿日期：2023-04-03 编辑：刘斌）

基金项目：四川省中医药管理局项目：2020CP0031；雅安市2021年度省级转移支付项目：22ZYZF0003。

作者简介：梁林辉（1986—），男，汉族，硕士，讲师、工程师，研究方向为天然药物化学。E-mail：llhui1986@126.com