B细胞在非感染性葡萄膜炎中的研究进展

杨园缘,王芷若,陈 功,陈慧慧

0 引言

葡萄膜炎是一种累及虹膜、睫状体、脉络膜及其周围组织的炎症,是世界范围内主要致盲原因之一。根据病因可分为感染性葡萄膜炎和非感染性葡萄膜炎(non-infectious uveitis, NIU),后者中相当一部分被认为是自身免疫性或免疫因素介导的[1]。目前主流观点认为NIU是CD4+T细胞亚群,尤其是效应性Th1细胞和Th17细胞与调节性T细胞(Treg)之间的比例失衡导致的[2]。各T细胞亚群通过白细胞介素、干扰素等细胞因子构建复杂的免疫调节网络来介导炎症反应。然而,B细胞作为适应性免疫应答的核心参与者之一,具有多种强大的免疫学功能,如分泌抗体和细胞因子、抗原提呈等[3]。尽管如此,它在NIU中的参与水平及方式却较少被讨论。近年来,B细胞耗竭疗法(B-cell depletion therapy, BCDT)在自身免疫性疾病的治疗中备受关注[4]。B细胞抑制剂利妥昔单抗(rituximab, RTX)在部分难治性NIU中也显示出良好的疗效[5-6],间接表明B细胞在NIU的发生和发展中极为重要。本文将对B细胞在NIU中的参与展开论述。

1 B细胞免疫学知识回顾

1.1B细胞发育和免疫耐受的建立B细胞起源于骨髓的造血干细胞,在发育过程中细胞表面表达随机组装B细胞受体(B cell receptor,BCR)并诱导免疫耐受,即当受到自身抗原刺激时不被激活;反之,若免疫耐受失调则会促使自身免疫病的发生[7-8]。最终,B细胞可分化为浆细胞或记忆细胞发挥体液免疫功能。

1.2B细胞功能B细胞与T细胞共同参与适应性免疫应答,具有多种免疫学功能[3],包括:(1)产生抗体:机体受到外界抗原刺激后,B细胞可分化浆细胞和记忆细胞,进而产生抗体与靶细胞抗原结合引起免疫反应;(2)分泌细胞因子:B细胞可以分泌各种白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素等,向各种免疫细胞传递信号,构成复杂的免疫调节网络;(3)抗原提呈:通过BCR,B细胞可识别并摄取外源抗原,经过MHC Ⅱ分子处理后提呈给T细胞;(4)构成三级淋巴结构。

1.3调节性B细胞B细胞可以根据细胞因子环境被划分为不同的功能亚群,其中调节性B细胞(Breg)与效应性B细胞起拮抗作用,主要分泌IL-10、IL-35、TGF-β等抑炎因子,有助于维持免疫耐受平衡[9-10]。

2 B细胞与EAU模型

2.1EAU模型为了更深入地理解自身免疫性葡萄膜炎的细胞和分子机制,我们通常使用实验动物模型来重现其临床表征。实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis, EAU)模型种类丰富,其动物及诱导抗原的选择具有多样性。视网膜可溶性抗原(S-Ag)、光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)、视紫红质、恢复蛋白等都可用于诱发EAU[11]。诱导方法主要包括主动免疫和过继性免疫[12]。通过在幼稚小鼠体内输注自身反应性Th17细胞,亦可诱发EAU。

2.2B细胞参与EAU模型目前,大多数EAU模型的机制研究围绕T细胞展开,产生IFN-γ的Th1细胞和产生IL-17的Th17细胞起关键致病作用,而Treg细胞则有助于疾病缓解[13-14]。虽然B细胞在葡萄膜炎中的参与程度及作用不如T细胞明确,但越来越多的证据表明,B细胞并不仅仅是一个旁观者,它在NIU中扮演着重要的角色。免疫组化结果显示,B细胞和浆细胞在EAU中存在浸润且在晚期逐渐占据主导地位[15]。这可能与血-眼屏障在终末期被破坏有关。有研究表明,在幼年特发性关节炎相关性葡萄膜炎(juvenile idiopathic arthritis-associated uveitis, JIAU)患儿的外周血中,Breg细胞比例明显降低,这可能成为判断疾病严重程度的潜在指标[16]。机体免疫调节呈现网络特性,需协调各类免疫细胞及细胞因子,并不是由单一细胞类型负责。仅仅强调T细胞在NIU中发挥作用的理论体系存在许多漏洞。有研究发现,IFN-γ缺陷小鼠反而发展成更严重的EAU[15]。另一方面,苏金单抗,一种IL-17A拮抗剂,并未显示出比安慰剂明显更好的疗效[17]。因此,我们有理由认为NIU机制研究中存在的空缺由免疫功能强大的B细胞填补。此外,眼睛是大脑的延伸,神经组织和眼组织起源于同一胚胎细胞,因而有研究者主张中枢神经系统自身免疫病和自身免疫性葡萄膜炎的发病机制存在互通点。在多发性硬化(multiple sclerosis, MS)患者体内,B细胞可通过多种途径参与MS发病,包括引发外周免疫耐受异常、增强向中枢神经系统迁移、介导异常抗体产生、参与抗原呈递过程以及促炎和抑炎因子分泌失衡等[18-19]。B细胞在MS及其动物模型的作用方式也可以成为我们推测葡萄膜炎发病机制的一个参考点。下文将对现有相关研究进行归纳与阐述。

2.2.1产生抗体B细胞可分化为产生抗体的浆细胞,进而与靶细胞抗原结合形成免疫复合物发挥生物效应,比如补体依赖性细胞毒性(CDC),抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。外周血中浆细胞比例呈现递增-递减趋势,消耗浆细胞可以改善EAU[20]。另外,T细胞联合血清比单独的T细胞转移更容易引发EAU,并且会持续加重病情,这表明抗体促使疾病发展[21]。由于抗体分子量较大,难以穿越血眼屏障进入眼内,因此B细胞在晚期屏障受损后才发挥明显的致病作用。利用生物荧光技术监测眼内免疫细胞的动态变化,发现B细胞直到EAU诱导28 d后才明显增加[22]。眼部浸润的B细胞数量增加可能与疾病持续时间的延长及病情的加重有关。有趣的是,在EAU诱导前后7 d给予B细胞耗竭剂可以得到完全不同的结果,表明早期B细胞具有保护作用,随后才转变为致病作用。这也进一步说明B细胞在NIU发病机制中的复杂性。

2.2.2抗原提呈B细胞还可作为抗原提呈细胞影响T细胞的活动进而间接发挥作用。RTX消耗CD20+B细胞,但不包括分泌抗体的浆细胞。研究显示,在某些NIU患者中,RTX取得不错疗效[5,23-24],这意味着B细胞在葡萄膜炎的致病过程中发挥除了分泌抗体之外的其他重要功能。目前关于B细胞在NIU中如何具体的发挥并调节间接功能的研究仍然不足。只有少量的文献显示葡萄膜炎中B细胞与T细胞的联系。B细胞表面必须表达MHC分子才能发挥抗原呈递作用。在EAE B-MHC Ⅱ-/-小鼠中,自身抗原诱导的疾病被消除,效应T细胞克隆扩张及应答显著减少,分化为记忆性T细胞的过程也受到影响[25]。此外,缺乏STAT3的B细胞通过促进致病性Th17细胞扩增和抑制Breg、Treg细胞分化而加重葡萄膜炎[26]。

2.2.3分泌细胞因子效应B细胞可产生促炎细胞因子,如IL-6、IFN-γ和GM-CSF;调节性B细胞产生抑炎因子,如IL-10、IL-35和TGF-β,负调控免疫应答[27]。自身反应性B细胞过度表达促炎细胞因子IL-6会加速实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的发展[28]。类似地,在敲除EAU小鼠的IL-6基因后,其眼部炎性反应明显减轻[29]。玻璃体腔内注射抗IL-6抗体也可减轻EAU症状[27]。同时,有研究表明葡萄膜炎患者的眼内液和外周血中的IL-6表达均显著升高[30-31]。IL-6可调节Treg/Th17平衡[32],还可诱导滤泡辅助T细胞(T follicular helper,Tfh)细胞分化[33]。B细胞协同T细胞、单核细胞、树突状细胞等大量分泌IL-6,共建炎性微环境,级联放大免疫反应,最终促成疾病的发生。其他的重要促炎细胞因子,比如IFN-γ和GM-CSF也有类似的作用[34-35]。另一方面,Breg细胞通过分泌IL-35、IL-10这样的抑炎细胞因子,抑制致病性Th1/Th17途径,促进Treg细胞和Breg细胞自身扩增,进而对葡萄膜炎乃至中枢神经系统自身免疫病起保护作用[36]。CD83+B细胞通过分泌可溶性CD83在EAU中发挥调节作用[37]。这启示我们,相比于泛性消耗B细胞,选择性消耗效应B细胞并同时保留调节B细胞可能是更有效的治疗方案。

2.2.4形成异位淋巴结构异位淋巴结构(ectopic lymphoid structure, ELS)是在非淋巴组织中发展的有组织性的免疫细胞聚集体[38]。在啮齿类动物和马的虹膜、睫状体和视网膜也曾描述过ELS样结构,并提示其与葡萄膜炎的慢性或复发性病程有关[39-40]。这些ELS样结构可能代表抗原特异性B细胞增殖、突变和成熟的场所,也是自身抗体的产生部位。

3 B细胞与人类NIU

人类NIU的种类极为复杂,目前已超过60种,并且还在持续增加。EAU模型与现实世界中的实质存在差距,没有任何一种动物模型能够完整地代表人类NIU谱系:(1)实验模型的抗原是单一固定的,而人类实体具有多样性和未知性。(2)还存在着基于眼部解剖特征、组织组成和成分功能的差异,例如,人类的脉络膜较鼠类更厚[41],并且脉络膜血流量丰富,被认为与自身免疫性炎症相关联[42]。(3)人类葡萄膜炎的发病常常呈现复发-缓解的特点,难以完全控制。因此,EAU模型的局限性提示人类葡萄膜炎具有更为复杂的内在发病机制,而B细胞的参与在其中起着重要的作用。

3.1B细胞参与人类NIU的证据NIU患者的脉络膜、虹膜、睫状体存在B细胞和(或)浆细胞浸润,虽然大多数以T细胞为主,但在某些情况下占据主导[43-44]。眼部结构组织标本通常在疾病终末期获取,具有慢性、反复发作的病程特点。值得我们考虑的是,B细胞浸润是否随着慢性病程的延续而增加,还是后者吸引来更多的B细胞?又或者两者是相互加强的循环?免疫组化的结果代表的是病程不同阶段还是继发性病理改变,这很难界定。外周血中B细胞总量正常,但其亚群发生显著改变,表现为幼稚B细胞减少,活化和记忆B细胞亚群水平的增加[45]。这反映了B细胞功能的变化。也有其他研究报道外周血B细胞总量降低,主要是CD27+记忆B细胞水平降低[46-48]。这种偏差可能解释为B细胞向炎症部位迁移,与疾病活动性和治疗效果有关。此外,与B细胞反应相关的滤泡T辅助细胞亚群也发生改变[49]。NIU患者血清酶联免疫吸附试验显示炎性细胞因子,如TNF-α、IL-6及B细胞相关因子(包括BAFF、APRIL、BCMA、BlyS)的水平增加[50-52];血清中免疫球蛋白及组织特异性抗原抗体滴度增加,JIAU患者虹膜B细胞相关蛋白MZB1也增加[53]。在眼内液,包括房水和玻璃体液中,也观察到B细胞相关炎性因子的上调[50,54]。近年来高通量基因测序分析在眼病中的应用越发广泛。从微观转录组学角度来看,葡萄膜及外周血的RNA转录组数据分析显示一系列涉及B细胞激活及分化相关的特异性差异基因上调、抑制BCR信号转导的基因下调以及B细胞相关信号通路富集[50,55]。此外,有研究采用单细胞测序技术(scRNA-seq)和流式细胞技术构建EAU和伏格特-小柳-原田综合征(Vogt-Koyanagi-Harada Syndrome,VKH)患者B细胞亚群免疫分型及丰度图谱[20],随后还发现自然杀伤样B细胞可能参与葡萄膜炎致病过程[56]。以上结果显示了B细胞免疫应答的激活在NIU发病机制中的可能作用。

3.2B细胞在人类NIU中发挥功能的途径总的来说,B细胞在葡萄膜炎中发挥功能的途径尚不明确,但我们可以从下面几个方面考虑:(1)直接的抗体依赖途径。外周免疫耐受失调,血-眼屏障被破坏,外周效应B细胞迁移并浸润在炎症部位,浆细胞分泌抗原特异性抗体进而介导免疫损伤。有个案报道患有抗体形成缺陷病的JIAU患者关节炎和葡萄膜炎症状都完全缓解了[57]。(2)B细胞还可充当抗原提呈细胞与T细胞互作,或者其他免疫细胞的互动,但在葡萄膜炎中尚缺乏直接研究证据。RTX在几种葡萄膜炎的成功应用证明了B细胞的间接作用。(3)正如上文所述,炎性细胞因子如IL-6和IFN-γ可由B细胞分泌,并且疾病组的浓度明显升高,这表明B细胞可以通过分泌多种细胞因子发挥作用。(4)少数人类眼组织标本具有ELS特征,并伴随着与B细胞功能相关的免疫基因的上调[58]。眼部特征性免疫细胞浸润,组织结构重塑和改变,形成组织内高度免疫监视,可能与葡萄膜炎中的B细胞免疫调节疗法有临床相关性,并影响葡萄膜炎的预后。

4 B细胞耗竭疗法在NIU中的应用

在历史上,NIU的治疗一直依赖于皮质类固醇药物。然而,激素的使用,尤其是长期或大剂量的使用,会导致全身和眼部的不良反应,如眼压升高、青光眼和白内障[59]。NIU的治疗重点是抑制过度的自身免疫反应,同时减轻药物毒副作用,减少眼组织损伤,最大程度地保护视功能。因此,基于疾病机制的方法最有可能在未来葡萄膜炎治疗方面取得突破,其中就包括了BCDT。它最初是用于消除癌性B细胞,现在可用于治疗自身免疫性疾病,包括NIU[4]。

4.1利妥昔单抗RTX是一种抗CD20人/鼠嵌合的单克隆抗体,可诱导耗竭CD20+B细胞[60]。对于那些对传统皮质类固醇和免疫抑制剂治疗无效的严重JIAU患者,经过RTX治疗后,大多数葡萄膜炎和关节炎的活动性趋于静止[61]。对于联合免疫抑制治疗无效的难治性VKH患者,RTX可减少激素用量并加强对炎症的控制[5,62]。一项关于多发性硬化相关性葡萄膜炎的回顾性研究显示,接受抗CD20制剂治疗后,患眼的玻璃体混浊、视网膜血管炎、黄斑水肿和视力都有显著改善,同时每年葡萄膜炎或多发性硬化复发的次数也有所减少,疾病活动也趋于静止[63]。然而,目前研究的样本量都较小,RTX尚未广泛应用于NIU的治疗中,其有效性与安全性仍需进一步的循证医学证据。

4.2其他B细胞抑制剂其他针对B细胞表面抗原和BAFF/APRIL的治疗药物,如奥妥珠单抗、贝利木单抗、泰它西普等,尚未被应用于葡萄膜炎的治疗。

5 总结与展望

本综述通过系统整理,全面评价了近年来B细胞在NIU研究领域的最新进展。我们认识到T细胞不再是NIU发病机制中的唯一主角。B细胞在EAU模型和临床患者中的参与已有充分证据支持。B细胞在病程中以抗体依赖或独立于抗体分泌的多种方式同样发挥至关重要的作用。然而,目前的研究尚不能完全解释以下科学问题:(1)B细胞诱导眼内组织特异性损伤的具体分子机制;(2)B细胞与T细胞、树突状细胞、小胶质细胞等其他免疫细胞互作模式;(3)不同病程阶段,如晚期、复发期等,B细胞及其亚群在组织内定位分布及功能的变化;(4)NIU种类繁杂,内部具有异质性,那么B细胞在不同类别NIU中的参与是否存在差异。为了更好地理解NIU的病理机制,研究者可从上述现存的问题出发,开展更进一步的研究。

RTX为难治性、反复性NIU患者提供了新的治疗选择,并且联合其他免疫抑制剂可能减少治疗周期和剂量。然而,其安全性和有效性仍有待更多大规模临床研究支持。各种靶向CD20、CD19和BAFF/APRIL通路的BCDT现在被用于治疗系统性红斑狼疮、多发性硬化症等自身免疫性疾病[64-65]。研究者可对比针对不同B细胞相关分子或特异性B细胞亚群的治疗效果,为NIU的个体化治疗提供支撑。除了抑制高度特异性和敏感性的致病性B细胞外,还应促进免疫调节性B细胞发挥功能。总而言之,我们可以尝试开发可靠的工具来监测B细胞及其在NIU的免疫活动反应,以寻找更安全有效的靶向B细胞的生物制剂,最终优化临床决策。