用于玉米品种真实性鉴定的最优核心SNP位点集的研发

田红丽 杨 扬 范亚明 易红梅 王 蕊 金石桥 晋 芳 张云龙 刘亚维 王凤格,* 赵久然,*

用于玉米品种真实性鉴定的最优核心SNP位点集的研发

田红丽1,**杨 扬1,**范亚明1,**易红梅1王 蕊1金石桥2晋 芳2张云龙1刘亚维1王凤格1,*赵久然1,*

1北京市农林科学院玉米研究所/ 农业农村部农作物DNA指纹创新利用重点实验室(部省共建) / 玉米DNA指纹及分子育种北京市重点实验室, 北京 100097;2全国农业技术推广服务中心, 北京 100125

品种真实性是种子质量监测的一个重要指标。为建立准确可靠、快速简便、高通量、低成本的玉米品种真实性鉴定技术, 本文利用200个核心SNP位点构建的5816个玉米杂交品种, 3274个自交系的指纹数据, 基于遗传算法、品种识别率评估确定了一套高鉴别力的核心SNP位点集, 包含96个SNP位点。这96个SNPs全部位于基因内区域, 相对均匀分布在10对染色体上。采用上述杂交品种和自交系的指纹数据评估显示这96个位点具有较高多态性和品种区分能力, PIC、MAF、DP平均值分别为0.36、0.40、0.60和0.36、0.39、0.48, 对杂交品种、自交系的品种识别率达到99.14%和99.24%。两两样品成对比较结果显示, 99.99%的品种间差异位点数目≥3个, 杂交品种和自交系中96.74%和95.67%的成对比较差异位点数目集中在30～65个和30～60个。基于221个主推杂交品种的40个SSR位点、96个SNP位点的基因型数据分析结果显示, 这2组标记集的鉴定结果具有较高的一致性。综上所述, 本研究报道了一套具有位点数量最少、区分能力最强, 兼容多平台、适于自动化分型等优点的最优核心SNP集。期望位点集将在玉米品种真实性监测、种子质量控制中得到广泛应用, 进而维护玉米种子市场秩序、保障育种者权利以及保护农民利益。

玉米品种; 真实性鉴定; SNP位点集; 高鉴别力

种子是农业现代化的基础。品种真实性是种子质量监测的一个重要指标, 如何快速准确的鉴定其真假, 对于保护育种者权益, 推动种业持续健康发展有着重要意义。随着种业的快速发展, 种子质量监管力度不断加大, 涵盖了企业抽查、市场检查、基地督查等; 监管重点不断变化, 监管内容由常规指标向真实性等侧重。玉米为全球第一大作物, 是我国总产最高、种业市值最大的作物, 也是种业市场监管重要作物之一。随着玉米种业的快速发展和生物育种技术的普及应用品种数量剧增, 截至当前我国已有审定玉米品种2万品次以上, 每年仍有近1万个品种组合在参试; 申请植物新品种权超过15,000件, 其中授权品种6000多件, 在农作物中排名第一(http://202.127.42.145/bigdataNew/)。玉米品种数量的爆发对真实性鉴定是极大的挑战, 迫切需要推荐一套区分能力最强、稳定性最好、兼容多平台、易整合共享的位点集, 建立高效精准的分子鉴定技术, 解决海量品种真实性鉴定的需求。

基因分型技术快速发展、不断与时俱进, 给利用更新更高效的分子技术手段有效鉴别品种真实性提供了可能。基于SSR分子标记, 玉米品种分子鉴定系列标准被陆续颁布[1-3]。利用上述标准, 北京市农林科学院玉米研究所构建了已包含10万多个样品、40个SSR标记的玉米标准DNA指纹库, 相关鉴定技术在种业领域中得到了广泛应用[4-5]。但是随着检测需求的不断变化, 颁布标准中的SSR标记集已难以满足对标记数量、检测通量、指纹数据整合共享等更高的要求。SNP标记是基于单个核苷酸多态性开发的标记, 具有在基因组上分布密度高、数据易整合、检测通量高等特征。同时玉米多个参考基因组序列的公布、大量重测序数据的释放、高通量分型平台的快速发展为SNP标记在品种鉴定领域中的应用奠定了良好基础[6-11]。在玉米标准指纹构建和鉴定技术研发方面, 基于SNP标记研制出高密度SNP芯片产品Maize 6H-60K, 评估确定系列核心位点集合如兼容型Maize SNP 384位点集、适于标准指纹构建的200个SNP等, 构建了已包含2万多个玉米品种SNP-DNA指纹库[12-15]。然而在玉米以及其他农作物品种真实性鉴定方面, 除了已发布的玉米、水稻、小麦品种真实性鉴定的3个行业标准之外, 基于SNP标记围绕品种真实性鉴定开展的系列研究报道非常少[16-21]。

常用的SNP标记检测技术主要有测序法、基因芯片和KASP (Kompetitive Allele Specific PCR)分型技术平台等。其中KASP技术为竞争性等位基因特异性PCR体系, 可兼容96、384和1536多种酶标板, 具有试验流程简单、样本通量高、试验设计灵活等特点, 尤其适合SNP二态性标记类型的基因分型检测[11]。本研究基于已构建的玉米品种SNP-DNA指纹库, 利用遗传算法, 筛选确定了一套适于真实性鉴定的高鉴别力最优SNP位点集[15]。利用已知品种对核心位点进行评估验证, 基于KASP平台建立快速高效精准玉米品种真实性鉴定技术, 以期为提高种子质量、维护种子市场秩序、保障农民合法权益提供有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

利用1984—2019年通过国家和各省审定的5816个玉米杂交品种, 3274个广泛代表性的玉米自交系的指纹数据从200个SNP位点中评估确定一套品种鉴别区分能力最强的核心位点集[15]。利用221个杂交品种评价SNP核心位点组合与40个SSR位点鉴定结果的相关性。221个杂交种为通过国家审定, 代表了我国主要推广种植的品种。选用了20套三联体(双亲及其F1)材料评价核心位点集的遗传稳定性, 具体包含郑单958、先玉335、京科968等种植面积较大的品种、区试审定试验对照品种、专用杂交品种等及其对应亲本。

1.2 总DNA提取

每个材料随机选取30个单株混合, 采用改良CTAB法提取总DNA, 并去除RNA[1-2]。用1%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计(Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific)检测DNA的质量和浓度, 工作液浓度统一稀释到20 ng µL–1备用。

1.3 SNP基因分型试验及基因型数据采集

SNP基因分型采用SNP-Line平台、KASP技术体系(Kompetitive Allele Specific PCR, LGC Genomics)。PCR扩增反应使用1536微孔板, 体系为1 µL, 包含1.5 µL DNA工作液(烘干), 0.5 µL 2× Master mix, 去离子水0.486 µL, 0.014 µL引物工作液(引物1、引物2和引物3浓度分别为12、12和30 μmol L–1, 附表1)。PCR扩增反应在水浴PCR仪(Hydrocycler- 64, LGC Genomics)上进行, 扩增反应程序为: 94℃ 15 min; 94℃ 20 s, 61～55℃ 60 s, 10个循环(每循环降低0.6℃); 94℃ 20 s, 55℃ 60 s, 26个循环。每板96个样品中放置2个参照样品、1个重复样品、1个空白。利用PHERAstar plate reader (LGC Genomics)荧光扫描仪对扩增后的产物进行扫描, 扫描结果利用Kraken软件(V17.12.8.19596, LGC Genomics)进行基因型数据采集。

1.4 数据分析

采用SNP/INDEL位点筛选工具LociScan_V1.0 (北京市农林科学院玉米研究所, 软著登记号为2018SR003573), 利用“基于遗传算法的植物品种真实性鉴定位点筛选方法”[22], 基于5816个杂交品种、3274个自交系的指纹数据, 从200个SNP位点中逐步抽取位点组合, 确定一套适于玉米品种真实性鉴定的、高鉴别力的最优SNP位点集[15]。200个SNP位点是从Maize 6H-60K芯片包含的61,214个SNP位点中, 根据位点的平台兼容性(芯片、KASP、靶向测序等平台)、均匀分布、多态性(能明确区分已知品种)、位点数目充分考虑未来品种情况兼顾检测平台通量特征等而综合确定的一套核心位点集[15]。利用SNP 比对统计工具V1.0 (北京市农林科学院玉米研究所, 软著登记号为2018SR026743)分析核心SNP位点的MAF (Minor Allele Frequency)、PIC (Polymorphism Information Content)、DP (Discrimination Power)以及杂合基因型频率(AB rate)。

利用Python3语言, 采用Biopython图形库绘制SNP核心位点在染色体上的物理位置示意图(https:// biopython.org/)。利用SNP比对统计工具V1.0, 基于5816个杂交品种、3274个自交系的核心SNP集的指纹数据, 计算品种间两两成对比较差异位点数; 选用221个杂交种的核心SNP和40对SSR指纹数据, 计算品种间的Nei1973遗传距离, 分析2种标记之间鉴定结果的相关性。基于Python3语言、采用matplotlib图形库绘制20套三联体材料的SNP-DNA指纹图谱(https://matplotlib.org/)[2,5]。

2 结果与分析

2.1 玉米品种真实性鉴定最优核心SNP位点集- 96个SNP位点的筛选确定

基于玉米SNP-DNA指纹库中5816个杂交品种、3274个自交系的指纹数据, 利用遗传算法从200个建库位点中逐步抽取最优位点组合, 包含的位点数目从2个增加到100个, 并分析其品种识别率的变化情况, 进而确定适于玉米品种真实性鉴定的位点数目和最优组合(图1)[15]。不同位点数目对于杂交品种、自交系2组材料的品种识别率(Variety Discrimination Power, VDP)情况为: 20个位点组合的品种识别率为89.80%、86.96%; 40、60和80个位点组合的品种识别率分别为96.14%、94.99%、97.68%、97.61%、98.45%、98.74%; 96个位点组合品种识别率达到99.14%和99.24%; 100个位点组合品种识别率达到99.17%和99.33% (图1)[23]。基于最优位点组合对玉米已知品种识别率的变化曲线图, 结合KASP基因分型平台特征, 确定具备高鉴别力的SNP位点集, 包含96个位点(附表1)。

图1 最优位点集的品种识别率变化曲线图

横坐标为位点组合包含的位点数目, 纵坐标为品种识别率。

The abscissa is the number of loci included in the loci combination, and the ordinate is the rate of variety discrimination power.

2.2 96个核心SNP位点的基本特征

根据96个核心SNP位点的物理位置绘制其在玉米核基因组的分布图(附表1和图2)。96个位点相对均匀分布在玉米10对染色体上, 3号、4号、7号和9号染色体分布9个位点, 其余染色体上分布10个位点(图2)。基于B73 AGPv3注释信息, 96个SNP核心位点均位于基因内区域, 其中50个(52%)位点位于exon区, 26个(27%)位于5'UTR和3'UTR区, 17个(18%)位于promotor区, 3个(3%)位于intron区。

基于5816个杂交品种、3274个自交系数据分析96个SNP的评估参数PIC、MAF、品种识别能力DP和杂合基因型频率(AB genotype rate, 杂合基因型标记数目/96) (图3)。杂交品种数据分析显示96个SNP位点的PIC、MAF、DP、杂合基因型频率值的变异范围分别为0.29～0.38、0.23～0.50、0.52～0.65、0.33～0.63, 平均值分别为0.36、0.40、0.60、0.48; 97%的位点PIC值高于0.30, 91%的位点MAF值高于0.30, 所有位点DP值均高于0.50, 在杂交品种材料中显示了较高的杂合基因型频率。利用自交系数据分析显示96个SNP位点的PIC、MAF、DP、杂合基因型频率值的变异范围分别为0.25～0.38、0.18～ 0.49、0.31～0.53、0.01～0.04, 平均值分别为0.36、0.39、0.48、0.01; 95%的位点PIC值高于0.30, 85%的位点MAF值高于0.30, 92%的位点DP值高于0.40,在自交系材料中显示了极低的杂合基因型频率。

图2 96个核心SNP位点在玉米核基因组上的分布

图3 基于5816个杂交品种、3274个自交系评估96个SNP位点的PIC、MAF、DP和杂合基因型频率(AB rate)分布

横坐标为SNP位点, 排序依据PIC值由小到大的顺序; 纵坐标为各评估参数值。

The abscissa is the SNP loci sorted by PIC value in descending order, the ordinate is the values of each evaluation parameter.PIC: polymorphism information content; MAF: minor allele frequency; DP: discrimination power; AB rate: AB heterozygous genotype rate.

2.3 96个核心SNP位点的品种鉴定能力

图1整体显示了96个SNP位点集对玉米已知品种累计识别率均已达到99%以上, 品种间两两成对比较的差异位点数目能具体反映位点组合区分品种的情况。图4为分别对5816个杂交品种和3274个自交系内两两样品成对比较, 统计差异位点分布情况, 总共比较对数分别为16,910,020和5,357,901对。

分别对杂交品种和自交系两两样品成对比较结果显示差异位点数目范围分别为0～83个和0～74个, 差异位点为0的样品为极近似或派生品种(图4)。对于杂交品种的鉴别: 差异位点数目分别为0、1、2、3个的分别占比0.0011%、0.0022%、0.0025%、0.0030%, 差异位点数目≥3个的占比99.99%, 差异位点数目≥20个的占比99.69%, 差异位点数目≥40个的占比87.00%, 差异位点数目≥60的占比9.96%, 差异位点数目≥70的占比0.16%, 96.74%的成对比较差异位点数目集中在30～65个。对于自交系的鉴别: 差异位点数目分别为0、1、2和3个的分别占比0.0025%、0.0043%、0.0055%和0.0067%, 差异位点数目≥3个的占比99.99%, 差异位点数目≥20个的占比99.30%, 差异位点数目≥40个的占比82.20%, 差异位点数目≥60的占比1.16%, 95.67%的成对比较差异位点数目集中在30～60个。

从玉米品种SSR-DNA指纹数据库中抽取221个杂交品种40对SSR引物的基因型数据[2,5]。利用221份杂交品种40个SSR位点、96个SNP位点的基因型数据, 计算两两样品之间的Nei1973遗传距离, 分析显示2种标记集鉴定结果具有较高的相关性。所有的数据点较集中分布, 并成线性关系, 皮尔逊相关系数值(Pearson’s Correlation Coefficient)值为0.63 (图5)。

图4 玉米自交系和杂交品种分别成对比较差异SNP位点数目分布图

图5 基于221个杂交品种两两遗传距离对96个SNP与40个SSR位点之间的相关性分析

选取包含郑单958、先玉335、京科968等推广种植面积较大的品种、以及区试审定对照品种等共20套三联体材料, 图像化展示其在96个SNP位点中的基因型数据, 10种颜色分别代表了不同的基因型和缺失数据(图6)。结果显示20套三联体材料在96个位点中无数据缺失, 且杂交种与父母本在每个位点上的指纹数据均符合遗传规律。

3 讨论

3.1 高鉴别力核心SNP位点集在玉米品种真实性鉴定中的应用优势

广义上的品种真实性鉴定包含品种真实性验证和真实性身份鉴定2个方面。品种真实性验证是指与其对应品种名称的标准样品比较, 检测证实供检样品的品种名称与标注名称是否相符; 主要是检测供检样品与标准样品之间的差异, 强调的是对结果的否定, 一般采用区分能力最强、位点数目最少的标记集合。品种真实性身份鉴定是确定供检样品的真实品种名称, 主要是确定2个样品是否相同, 强调的是对结果的肯定, 一般采用全基因组均匀分布的高密度位点集合[24-25]。本文确定的一套高鉴别力最优核心SNP位点集主要是用于品种真实性验证, 具备满足品种真实性验证位点组合的以下优势特征。第一, 位点数量最少、品种区分能力最强。本文筛选确定的96个SNP位点, 是利用5816个杂交品种、3274个自交系(基本涵盖了玉米已知品种)进行评估筛选, 基于最优遗传算法从1个位点开始增加位点数目, 并且每轮都是寻找累计品种区分能力最强的一组位点。结合KASP等分型平台特征, 最终确定了一套高鉴别力核心SNP位点集。该集合能够区分99%以上的自交系和杂交品种, 体现了用最少位点区分最多品种的目的, 达到样本通量高、检测成本低的效果。第二, 位点适于自动化基因分型。96个位点在芯片、KASP等平台每个位点的分型效果均体现了3种基因型的数据点各自内聚, 且有明显的界限特征。因此在进行基因型读取时易于自动化读取, 无需人工校正。第三, 位点兼容多平台。用于玉米标准SNP-DNA指纹构建的200个核心位点, 为利用大量样品通过芯片、定点测序、KASP平台的评估验证, 具有较好分型效果的位点[15]。96个位点则是进一步通过多平台、多实验室验证, 在样本高通量平台如KASP、TaqMan等平台呈现完美分型效果的位点。同时由于96个SNP位点通过了多个平台验证, 说明位点侧翼序列具有较好的保守性、易设计引物或探针, 即使再扩展到其他平台, 也具有很高的技术平台兼容型。

图6 20套三联体(杂交品种及其双亲)样品96个位点的SNP-DNA指纹展示图

每行代表1个样品, 每3行代表1套三联体样品, N01～N20为三联体样品的编号; 每列代表1个SNP位点, 按照在基因组上的物理位置排序; DNA指纹分别用不同颜色表示。

Each row represents one variety, each three rows represent one set of triplet samples, N01–N20 are the numbers of the triplet samples; each column represents one SNP locus sorted by physical location on genome; DNA fingerprints are displayed in different colors.

3.2 96个核心SNP位点在玉米品种真实性验证中的应用方案

基于推荐的96个核心SNP位点开展玉米品种真实性验证时, 实验室可统筹考虑检测样本规模、已有分型平台(如KASP、荧光定量PCR、TaqMan探针法等), 制定相应的检测方案。由于品种真实性验证的目的为判定供检种子是否为假种子、主要是找不同, 故允许采用序贯法方式检测, 若检测到足够的差异位点可终止检测, 对于结果的判定依据差异位点数目给出鉴定意见。

玉米品种真实性验证的判定阈值需综合考虑玉米品种间、品种内差异, 现行标准以及玉米种业现状等各种因素。第一, 玉米不同品种间的差异情况。本文中通过大量已知品种(5816个杂交品种和3274个自交系)两两比对结果显示: 已知自交系、自交系, 差异位点数目在0、1、2和3占据比例极少在0.0067%以内, 差异位点数目≥3个的占比99.99%, 95%以上的成对比较差异位点数目集中在30～65个之间。第二, 玉米品种内差异情况。玉米杂交品种存在其亲本中极少数位点未完全纯合的情况, 未纯合位点的基因型会随着亲本的提纯而发生变化, 在杂交品种会呈现分离。品种真实性验证的判定阈值需考虑此情况, 避免将不同繁种世代的种子误判为不同品种的可能, 因此应允许品种内不同个体存在极小的变异。第三, 现行相关标准的情况。现行玉米品种真实性鉴定SSR标记法标准中判定不同的阈值为2, 即达到5%的位点差异判定为不同。但是由于单个SNP比单个SSR位点品种区分能力低, 因此SNP标记法差异位点的比例低于5%。综上所述, 基于96个核心SNP位点的玉米品种真实性验证标准中判定阈值推荐为3个位点[2,16]。当供检样品与标准样品比较差异位点数目≥3, 排除两者为同一品种; 供检样品与标准样品比较差异位点数为1或2, 不确定两者为同一品种; 供检样品与标准样品比较差异位点数为0, 不排除两者属于同一品种。

3.3 96个核心SNP位点集在玉米品种真实性鉴定中的应用前景

种子是农业现代化的基础, 关系国家粮食安全和长远发展。我国最早于1962年发布《关于加强种子工作的决定》; 2000年《种子法》开始实施, 农作物种业开启市场化改革, 形成了数量庞大的种子企业; 2021年通过的《种业振兴行动方案》, 提出加强知识产权保护、优化营商环境, 要推行全链条、全流程监管, 对假冒伪劣、套牌侵权等突出问题要重拳出击。真实性鉴定是种子质量监管中的重要内容, 是评价种子等级的主要依据, 是保障优良品种遗传特征充分发挥、保障稳产高产的有效措施。玉米蕴藏巨大经济价值, 作为第一大农作物真实性鉴定需求量最高, 同时也一直是首要的关键监管作物。就政府需求而言, 监管力度不断加大, 包含了制种基地督查、企业抽查、市场检查、市场摸底行动。从市场需求分析, 来自于企业质检、工商打假、司法鉴定、科研育种、农民维权等方面的真实性检测需求逐步上升。同时随着近些年品种数量的爆发, 其种子真实鉴定样本数量也在急剧增加。面对上述需求, 高效精准低成本的检测技术一直是研究者的追求目标。利用本文筛选确定的高鉴别力最优SNP位点集, 结合样本高通量的KASP平台建立准确可靠、快速简便、高通量、低成本的玉米品种真实性鉴定技术, 解决了指纹数据整合共享的问题, 提高了检测规模和自动化水平, 技术可在种子监管、品种创新、市场需求中展现良好的应用前景, 保障种业的健康稳定发展。

4 结论

利于5816个玉米杂交种, 3274个自交系的指纹数据, 筛选确定了一套适于真实性鉴定的高鉴别力、高准确性、高稳定性、兼容多平台的SNP位点集(包含96个SNP位点), 基于KASP平台建立高效精准快速的玉米品种真实性鉴定技术, 为保障种子质量、维护种子市场秩序、保障农民合法权益等提供技术支撑。

附表 请见网络版: 1) 本刊网站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中国知网http://www.cnki.net/; 3) 万方数据http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical- zuowxb.aspx。

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Development of an optimal core SNP loci set for maize variety genuineness identification

TIAN Hong-Li1,**, YANG Yang1,**, FAN Ya-Ming1,**, YI Hong-Mei1, WANG Rui1, JIN Shi-Qiao2, JIN Fang2, ZHANG Yun-Long1, LIU Ya-Wei1, WANG Feng-Ge1,*, and ZHAO Jiu-Ran1,*

1Maize Research Institute, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Key Laboratory of Crop DNA Fingerprinting Innovation and Utilization of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs (Co-construction by Ministry and Province) / Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding, Beijing 100097, China;2National Agricultural Technology Extension and Service Center, Beijing 100026, China

Variety genuineness is an important indicator for seed quality monitoring. In order to establish accurate, reliable, fast, simple, high-throughput, and low-cost maize variety genuineness identification technology, we evaluated and determined a set of high discriminative power core SNP loci set including 96 SNPs based on SNP fingerprint data of 5816 maize hybrids and 3274 inbred lines using the genetic algorithm and variety recognition rate. All 96 SNPs were located in the intra-gene region, generally distributed evenly on 10 pairs of chromosomes. The evaluation results using the above hybrid and inbred line data showed that 96 SNPs set had high polymorphism and variety discrimination power. The average values of PIC, MAF, and DP were 0.36, 0.40, 0.60, and 0.36, 0.39, 0.48 for hybrids and inbred lines, respectively. The variety discrimination power for hybrids and inbred lines reached 99.14% and 99.24%, respectively. Pairwise comparison between varieties showed that 99.99% of the comparisons had at least three differential loci. About 96.74% of hybrids and 95.67% of inbred lines mostly had the 30−65 and 30−60 differential loci between varieties, respectively. Compared with the 40 SSRs genotype dataset using 221 hybrids, the 96-SNPs set had high consistency in the identification results of the two marker sets. In summary, the optimal core SNPs set reported in this study had the advantage of the minimum number of loci, the highest discrimination power, the strongest differentiation platforms, and the automatic genotyping. It is expected that the extensive application of this core SNP loci set will be widely used in maize variety genuineness monitor and seed quality control for maintaining seed market order, so as to defend the breeders’ rights and protecting interests of farmers.

maize variety; genuineness identification; SNP loci set; high discrimination power

10.3724/SP.J.1006.2024.33052

本研究由国家科技创新重大项目(2022ZD04019)和北京市农林科学院财政项目(KJCX20230301, CZZJ202206)资助。

This study was supported by the National Scientific and Technological Innovation-Major Projects (2022ZD04019) and the Financial Project of Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences (KJCX20230301, CZZJ202206).

赵久然, E-mail: maizezhao@126.com, Tel: 86-10-51503936; 王凤格, E-mail: gege0106@163.com, Tel: 86-10-51503558

**同等贡献(Contributed equally to this work)

田红丽, E-mail: tianhongli9963@163.com; 杨杨, E-mail: caurwx@163.com; 范亚明, E-mail: 13718078547@163.com

2023-10-25;

2024-01-12;

2024-02-08.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240206.1450.008

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