基于HPLC法测定酱卤肉制品中山梨酸含量的不确定度分析评定

王铭海 张亦凡 龙娇 李丹

摘 要：本文依据《国家计量技术规范 测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）对基于HPLC法测定酱卤肉制品中山梨酸含量的不确定度进行了综合分析评定。结果表明，山梨酸含量为0.029 0 g·kg-1，其相对标准不确定度为0.041，扩展不确定度为0.002 4 g·kg-1（p=95%，k=2）。该测定方法中标准曲线拟合、仪器测定和标准系列溶液配制对不确定度的影响较大，其他因素则影响较小。

关键词：不确定度；酱卤肉；山梨酸；液相色谱法

Analysis and Evaluation of Uncertainty in the Determination of Sorbic Acid in Pot-Stewed Meat by HPLC

WANG Minghai1，2， ZHANG Yifan3， LONG Jiao1，2， LI Dan1，2

（1.Xixiang County Food & Drug Inspection and Testing Center， Xixiang 723500， China;

2.Xixiang County Quality Technical Supervision and Testing Center， Xixiang 723500， China;

3.Hanzhong Food & Drug Supervision and Testing Center， Hanzhong 723000， China）

Abstract： According to the provision of JJF 1059.1—2012， the uncertainty of the method in the determination of pot-stewed meat by HPLC was analyzed and evaluated comprehensively in this article. The results showed that the content of sorbic acid was 0.029 0 g·kg-1， the relative standard uncertainty was 0.041， and the expansion of uncertainty was 0.002 4 g·kg-1（p=95%， k=2）. In this determination method， the standard curve fitting， the instrumental determination and the preparation of standard series solutions have a significant influence on the uncertainty， other components have a little effect on the uncertainty.

Keywords： uncertainty; pot-stewed meat; sorbic acid; liquid chromatography

山梨酸，化学式C6H8O2，又称凉茶酸，2，4-己二烯酸，是被联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）共同推荐的安全性高、适用性强的食品防腐保鲜剂之一，以其安全、经济、高效等诸多优点被广泛应用于延缓酱卤肉、糕点、饮料等食品腐败变质，保持其营养成分及口感风味等方面[1]。本文按照《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）中第一法液相色谱法，依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）建立酱卤肉中山梨酸测定的不确定度评定方法[2]，分析评定对测定结果影响较大的不确定度分量因素，从而为优化实验操作、提升数据质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山梨酸标准溶液（浓度为1 000 mg·L-1，北京海岸鸿蒙）；甲醇（色谱纯，美国费希尔）；亚铁氰化钾、乙酸锌（分析纯，成都科隆）；乙酸铵（优级纯，国药集团）；实验用水符合《分析实验室用水规格和试验方法》（GB/T 6682—2008）规定的一级水要求。

1.2 仪器与设备

安捷伦1260高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器）；色谱柱；分析天平（感量0.1 mg），梅特勒-托利多（上海）；移液器（10～100 μL、100～1 000 μL和500～5 000 μL）；容量瓶（10 mL和50 mL）；高速臺式离心机；涡旋振荡器与超声波提取机。

1.3 试样制备及处理

依据《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）中第一法液相色谱法[3]进行试样制备及处理，具体步骤如下。准确称取约2 g经粉碎均匀处理后的酱卤肉试样于50 mL具塞离心管中，加入约25 mL水，涡旋混匀后进行超声提取（50 ℃，20 min），自然冷却至室温，再分别加入蛋白沉淀剂（106 g·L-1亚铁氰化钾溶液和220 g·L-1乙酸锌溶液）各2 mL，充分振荡混匀，第一次离心处理（8 000 r·min-1，5 min），转移上清液至50 mL容量瓶中，加水约20 mL于下层残渣中，涡旋混匀后超声提取5 min，第二次离心处理（条件同前次），同样转移上清液至以上容量瓶中，用水定容并充分混匀。取适量上清液过滤膜（0.22 μm，水相），供液相色谱检测用。

1.4 标准工作溶液配制

100 mg·L-1山梨酸标准储备液配制：准确吸取1 mL山梨酸标准溶液（1 000 mg·L-1）至10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作标准储备液使用。

山梨酸标准系列溶液配制：分别准确吸取上述山梨酸标准储备液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和5.0 mL，加水定容至10 mL，配制成质量浓度为1.00 mg·L-1、5.00 mg·L-1、10.00 mg·L-1、20.00 mg·L-1和50.00 mg·L-1的标准系列溶液。

1.5 色谱条件

色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙酸铵溶液（20 mol·L-1）+甲醇=95+5；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：230 nm；进样量：10 μL；柱温：20 ℃。

2 结果与分析

2.1 计算公式

酱卤肉试样中山梨酸含量计算公式为

2.2 不确定度分量的来源分析

综合考虑样品检测过程和数据分析模型各影响因素可知，山梨酸含量测定不确定度主要来源于样品称量、试样前处理、标准系列溶液配制、仪器测定、测量重复性、加标回收试验、标准曲线拟合等分量因素的影响。

2.3 不确定度分量的分析评定

2.3.1 样品称量引入的相对标准不确定度urel（m）

准确称取试样2.001 6 g，查阅《电子天平检定规程》（JJG 1036—2022）[4]及天平检定证书可知，该天平最大允差为±0.5 mg，按均匀分布考虑，取k=，属B类评定，则其带来的相对标准不确定度为

2.3.2 试样前处理引入的相对标准不确定度urel（q）

（1）量器校准引入的相对标准不确定度urel1（q）。试样前处理过程中，对测定结果有直接影响的量器为容量瓶，经查《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[5]及检定证书可知，50 mL A级容量瓶容量允差为d=±0.05 mL，按均匀（矩形）分布考虑，取k=，属B类评定，则由此带来的相对标准不确定度为

（2）温度变化引入的相对标准不确定度urel2（q）。本次测定在室温（20±5）℃条件下进行，该条件下溶液（纯水）的体积膨胀影响远大于量器的体积膨胀，故此处量器体积膨胀可不作考虑。经查得20 ℃时纯水的体积膨胀系数a=0.000 21 ℃-1[6]，按均匀（矩形）分布考虑，取k=，属B类评定，则由温度影响产生的体积变化为±（50×5×0.000 21）mL。于是，其相对标准不确定度为

综上，由试样前处理引入的相对标准不确定度为

2.3.3 标准系列溶液配制引入的相对标准不确定度urel（p）

（1）标准物质纯度引入的相对标准不确定度urel1（p）。经查厂家提供的山梨酸标准物质证书可得，山梨酸标准溶液（BW 100170-1）浓度为1 000 mg·L-1，Urel=3.0%（k=2），则由此引入的相对标准不确定度为。

（2）量器校准引入的相对标准不确定度urel2（p）。

标准系列溶液配制过程中使用到的量器有移液器和容量瓶，移液器（100～1 000 ?L、500～5 000 ?L）的相对扩展不确定度Urel及k值可通过校准证书查得，计算公式为，而使用到的10 mL容量瓶不确定度的计算公式同上文2.3.2（1）为，则各不确定度来源及评定结果详见表1。

于是，其合成相对标准不确定度为

（3）温度变化引入的相对标准不确定度urel3（p）。因實验室环境温度变化引起的不确定度计算方法同2.3.2（2），此处不再重述，各操作步骤的不确定度来源及评定结果详见表2所示。将表2中各不确定度分量进行合成，则其相对标准不确定度为

综合以上分量可得，由标准系列溶液配制引入的相对标准不确定度为

2.3.4 液相色谱仪测定引入的相对标准不确定度urel（y）

仪器测定引入的不确定度主要包括仪器检测系统引入的不确定度和峰面积重复测量引入的不确定度。

（1）仪器检测系统引入的相对标准不确定度urel1（y）。经查仪器检定证书可得，仪器检测器定量重复性允许误差为3.0%，按均匀（矩形）分布考虑，取k=，属B类评定，则其相对标准不确定度为。

（2）峰面积重复测量引入的相对标准不确定度urel2（y）。在本次评定中，采用10.0 mg·L-1的标准使用溶液重复测定6次，测得峰面积分别为556、547、555、549、552和561，峰面积的平均值为553，按A类评定，则其标准不确定度及相对标准不确定度分别为

综上，由液相色谱仪测定引入的相对标准不确定度为

2.3.5 测量重复性引入的相对标准不确定度urel（c）

按照1.3样品处理方法，对实验室阳性质控酱卤肉样品进行10次重复测定，山梨酸含量检测结果分别为0.028 8 g·kg-1、0.029 2 g·kg-1、0.029 0 g·kg-1、0.029 0 g·kg-1、0.028 6 g·kg-1、0.028 9 g·kg-1、0.029 1 g·kg-1、0.028 7 g·kg-1、0.029 4 g·kg-1和0.028 8 g·kg-1，浓度平均值为0.029 0 g·kg-1，按A类评定，则其标准不确定度与相对标准不确定度分别为

2.3.6 加标回收试验引入的相对标准不确定度urel（h）

对无本底样品基质分别进行高、中、低3个浓度加标试验，9次重复测定，其回收率分别为98.2%、98.1%、98.2%、96.5%、96.6%、96.4%、95.3%、95.2%和95.2%，回收率平均值为96.6%。按A类评定，则其标准不确定度及相对标准不确定度分别为

2.3.7 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel（s）

将上述配制的5个浓度标准系列溶液直接上机测定，每个浓度点重复测定2次，通过仪器配套数据处理软件拟合生成线性回归方程，可得到各校準点C对应的色谱峰面积A，具体测定结果如表3所示。因此，标准溶液峰面积残差的标准差和标准曲线拟合所产生的标准不确定度为

式中：b为斜率，b=56.257 54；a为截距，a=-8.597 82；Ai为各浓度标准系列溶液的峰面积；n为标准系列溶液的测定次数，n=10；为标准系列溶液浓度平均值， mg·L-1；Ci为标准系列溶液对应的浓度值；p为试样测定次数，p=6；根据2.3.5数据，由公式（1）计算可得，试样10次重复测量的质量浓度平均值=1.16 mg·L-1。

通过公式（2）和（3）代入计算可得，S=3.67 mg·L-1，u（s）=0.038 mg·L-1，于是其相对标准不确定度为

2.4 合成相对标准不确定度

综上所述，各不确定度分量及来源如表4所示，由此可得其合成相对标准不确定度为

2.5 扩展不确定度及结果报告

本次分析评定中，酱卤肉试样中山梨酸含量为0.029 0 g·kg-1，按正态分布，取k=2（置信水平95%）[7]，则其扩展不确定度U=X×urel（X）×k=0.029 0×0.041×2=0.002 4 g·kg-1。

根据以上不确定度评定的结果，则采用高效液相色谱法测定酱卤肉中山梨酸含量的结果报告应报告为X=（0.029 0±0.002 4）g·kg-1，k=2。

3 结论

对各不确定度分量及来源按相对贡献率大小排序分析可知，标准曲线拟合、仪器测定因素和标准系列溶液配制对酱卤肉中山梨酸含量测定不确定度影响较大；加标回收试验、测量重复性、样品前处理、样品称量因素则影响较小。因此，在实际检测工作中对关键影响因素进行针对性把控则显得尤为重要，即标准溶液的稀释配制应严格规范操作，测量仪器选配方面应兼具仪器精密度、软件分析性能和性价比等因素，从而提升测量数据的准确可靠性。

参考文献

[1]陆晶芳，倪未霞，林捷，等.高效液相色谱法测定果汁饮料中山梨酸含量的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2019，10（21）：7373-7378.

[2]国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中国计量出版社，2012.

[3]国家食品药品监督管理总局，国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定：GB 5009.28—2016[S].北京：中国计量出版社，2016.

[4]国家市场监督管理总局.电子天平检定规程：JJG 1036—2022[S].北京：中国计量出版社，2022.

[5]国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器检定规程：JJG 196—2006[S].北京：中国计量出版社，2006.

[6]王俊越，张玮，里佐威.水体膨胀系数随温度变化的测定[J].物理实验，1999（3）：6-19.

[7]张前程.高效液相色谱法测定茶干中山梨酸含量及其不确定度评定[J].现代食品，2023，29（9）：177-180.

作者简介：王铭海（1988—），男，陕西西乡人，硕士，工程师。研究方向：食品安全检验分析与计量技术管理。