免疫亲和层析高效液相色谱法对小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定

荣明华

摘 要：目的：建立测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的免疫亲和层析高效液相色谱法。方法：小麦粉经粉碎处理，用水提取，通过免疫亲和柱上样、净化和洗脱后，用高效液相色谱仪测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。结果：在100～5 000 ng·mL-1，方法的线性关系良好，相关系数（R2）为0.999 8，检出限为48 ng·mL-1，回收率为90.1%～109.6%，相对标准偏差为1.49%～2.20%。结论：该方法操作步骤简便，特异性强，精密度高，可以作为大批量分析小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的处理方案。

关键词：小麦粉；脱氧雪腐镰刀菌烯醇；免疫亲和柱

Abstract： Objective： To establish an immunoaffinity chromatography method for the determination of deoxynivalenol in wheat flour. Method： Wheat flour was crushed and extracted with water. After immunoaffinity column sampling， purification and elution， the content of deoxynivalenol in wheat flour was determined by HPLC. Result： In the range of 100～5 000 ng·mL-1， the linearity of the method was good， the correlation coefficient （R2） was 0.999 8， the detection limit was 48 ng·mL-1， the recovery was 90.1%～109.6%， and the relative standard deviation was 1.49%～2.20%. Conclusion： The method is simple， specific and precise， and can be used as a treatment scheme for mass analysis of deoxynivalenol content in wheat flour.

Keywords： wheat flour; deoxynivalenol; immunoaffinity columns

脫氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又称呕吐毒素，化学式为C15H20O6。它主要是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀杆菌产生的有毒代谢产物[1]。在我国小麦赤霉病频发地区，禾谷镰刀菌是占比较高的致病菌种[2]。当动物食入含有DON的食物后，会产生呕吐等急性中毒症状，长期低剂量摄入含DON的食物会引起厌食、生长缓慢、免疫毒性和母性毒性导致的生殖发育障碍[3]。我国流行病学研究表明，呕吐毒素也可能对人类产生催吐作用[4]。与此同时，近几年的研究表明人类食管癌、免疫球蛋白A肾病的患病原因可能与DON有关，严重威胁了人们和动物的身体健康[5]。由于我国居民在日常生活中食用小麦粉谷物加工制品比例较高，因此受到DON毒素危害的影响更为明显。

河南省是“中原粮仓”，是粮食产出、消费及储备大省。粮食安全关乎人们的切身利益及社会的稳定发展，因此保障粮食安全是重中之重。数据显示，2018—2019年对159份小麦粉样品进行检测时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出率为78.0%[6]。该结果说明小麦粉中DON的检出率极高。因此，需要更准确、快速的检测手段对小麦粉制品中存在的DON进行检测。免疫亲和柱层析作为前处理技术，其具有操作步骤简单、敏感度高、可以特异识别和结合抗体、有效提高样品净化纯度的特点[7]。本文通过免疫亲和柱层析法，使用高效液相色谱仪检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，为处理大量小麦粉样品提供方案。

1 材料与方法

1.1 材料

河南省省抽第一季度小麦粉阴性样品。

1.2 试剂

脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品[GBW（E）100304，浓度为100.0 ?g·mL-1，国家粮食和物资储备局科学院研究院]；甲醇（色谱纯）；氯化钠（分析纯）；超纯水。

1.3 仪器与设备

电子天平（ME204E，METTLER TOLEDO）；TG16-WS台式高速离心机（湘仪）；UPR-II-10T超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；J2 Scientific PPM48正压固相萃取净化仪；免疫亲和柱（德国r-biopharm公司）；MFV-12氮吹仪（得泰仪器）；微孔滤膜（0.22 ?m，津腾）；HD-2500多管漩涡混合仪（杭州佑宁仪器）；Venusil XBP C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m，Agela Technologies）；Agilent 1260高效液相色谱仪；DHP-9032电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 标准溶液的配制

吸取1 mL DON标准品于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线得到10 000 ng·mL-1的DON标准中间液。分别吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和5.0 mL的DON中间液于10 mL容量瓶中，得到100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、1 000 ng·mL-1、2 000 ng·mL-1和5 000 ng·mL-1的系列标准工作液，储藏于4 ℃冰箱，保质期为7 d。

1.4.2 样品前处理

将大于1 kg的小麦粉样品粉碎混合均匀分装至样品袋中，密封至干燥处保存，供实验所用。在100 mL锥形瓶中加入25 g小麦粉样品，5 g氯化钠，200 mL超纯水混匀。置于多管漩涡混合仪上振荡5 min，5 000 r·min-1离心5 min，经滤纸过滤。将处于4 ℃存放的免疫亲和柱置于电热恒温培养箱中，设置温度为25 ℃，待免疫亲和柱恢复至室温。保持实验室温度在24～28 ℃，将转向柱顶部拆下，待免疫亲和柱保护液流尽，取2 mL滤液至免疫亲和柱中，使用正压固相萃取净化仪调节滤液并保持稳定、缓慢的速度通过免疫亲和柱，确保滤液与抗体凝胶充分接触。用10 mL超纯水洗涤免疫亲和柱，直到空气进入亲和柱，确保除去残留液体。加入2 mL 100%甲醇洗脱柱子，使用5 mL试管收集流出液。将试管嵌于氮吹仪上，在50 ℃水浴下蒸发吹干。移取1.0 mL 20%甲醇水于试管中，旋转振荡20 s，经0.22 ?m滤膜过滤，用样品瓶收集滤液待检测分析，同时做空白实验。

1.4.3 色谱检测条件

Venusil XBP C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m，Agela Technologies）；流動相比例：甲醇∶水=20∶80；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样体积：50 ?L；检测波长：218 nm。

2 结果与分析

2.1 柱容量验证实验

取浓度为100.0 ?g·mL-1的DON标准品0.06 mL于5 mL水中，充分振荡得到浓度为1 200 ng·mL-1的混合液，依次移取1 mL混合液至同一批次3根免疫亲和柱中。混合液经提取、净化和洗脱后，在50 ℃氮气下吹干，在5 mL试管中加入1 mL初始流动相甲醇水（20+80），涡旋振荡，使用高效液相色谱仪测定待测液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量。如表1所示，同批次3根免疫亲和柱过柱后，测定的DON含量的平均值为1 000 ng，回收率为83.3%。该批次免疫亲和柱符合国标《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB 5009.111—2016）免疫亲和柱参数要求（DON≥1 000 ng，回收率≥80%），可以使用[6]。

2.2 标准曲线和方法检出限

依次对1.4.1系列工作液进行检测，以DON浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。由图1可知，在100～5 000 ng·mL-1，线性方程为y=0.057 08x+0.841 3（R2=0.999 8），线性关系良好。以最低浓度100 ng·mL-1的3倍信噪比作为最低检出限，得到最低检出限为48 ng·mL-1，低于国家标准（50 ng·mL-1），满足日常检测需求。

2.3 精密度试验

取1.4.1中500 ng·mL-1的DON标准工作液连续进针6次，测定结果的平均相对偏差为0.86%，精密度良好，满足国家标准GB 5009.111—2016的要求，即在重复性实验条件下计算得到的两次测定值的绝对差值不高于算术平均根的23%[6]。结果见表2。

2.4 回收率试验

称取3份阴性小麦粉样品25 g进行加标回收试验，向其中依次添加浓度为250 ng·mL-1、500 ng·mL-1、1 000 ng·mL-1的DON标准物质溶液，按1.4.2样品前处理进行6次平行实验。由表3可知，加标回收率在90.1%～109.6%，相对标准偏差在1.49%～2.20%，符合《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）要求。

3 结论

本文建立了免疫亲和层析高效液相色谱法对小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量测定的方法。该方法的检出限为48 ng·mL-1，平均相对偏差为0.86%。除此之外，该方法的样品前处理过程简单，灵敏度高，重复性良好，使用试剂较少，可以有效减少试剂配制过程中的人为误差，可满足日常工作中对大量小麦粉样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测。

参考文献

[1]阮双，司红起.小麦DON毒素研究进展[J].生物技术进展，2021，11（5）：634-641.

[2]杨继芝，王继师，龚国淑，等.不同禾谷镰刀菌对小麦产量及其主要性状的影响[J].河南农业科学，2010（9）：91-95.

[3]PESTKA J J.Deoxynivalenol： mechanisms of action， human exposure， and toxicological relevance[J].Arch Toxicol，2010，84（9）：663-679.

[4]PESTKA J J，SMOLINSKI A T.Deoxynivalenol：toxicology and potential effects on humans[J].J Toxicol Environ Health B Crit Rev，2005，8（1）：39-69.

[5]尹杰，伍力，彭智兴，等.脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性作用及其机理[J].动物营养学报，2012（1）：48-54.

[6]李俊玲，王书舟，吴俊威，等.河南省粮食及其制品中真菌毒素污染[J].中国食品卫生杂志，2020，32（4）：418-421.

[7]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定：GB 5009.111—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.