24重荧光real-time PCR技术在食物中毒快速检测中的应用

2024-04-27卢媛钟颖涛

食品安全导刊·中旬刊 2024年2期

卢媛钟颖涛

摘要：目的：应用24重荧光real-time PCR检测技术快速筛检食物中毒病原菌，结合国家标准中的培养法探讨24重荧光real-time PCR检测技术符合性和应用价值。方法：采用高灵敏度、高特异性的24重荧光real-time PCR检测技术作为中毒病原菌的初筛方法，国标方法进行细菌分离培养，并对分离出的病原菌进行生化鉴定。结果：5份食物中毒患者肛拭子在增菌前检出4份霍乱弧菌核酸（非O1/非O139群，24重荧光real-time PCR），9份患者肛拭子在增菌后检出5株霍乱弧菌（非O1/非O139群，国标培养法），其中包含4份PCR技术初筛阳性样品，两个方法的符合率为80%。所有样本均未检出沙门氏菌、志贺菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠埃希菌以及金黄色葡萄球菌。结论：应用24重荧光real-time PCR检测技术同时检测24种常见致病病原菌，能高效锁定中毒病原菌。将其与国标培养法相结合，对临床治疗和食物中毒快速处置能起到积极作用，值得应用和推广。

关键词：24重熒光real-time PCR技术；培养法；食物中毒

Abstract： Objective： To use 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology to rapidly screen food poisoning pathogens， and to explore the compliance and application value of 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology combined with national standard culture method. Method： The 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology with high sensitivity and specificity was used as the primary screening method for toxic pathogens， and the bacteria were isolated and cultured by national standard method， and the isolated pathogenic bacteria were biochemically identified. Result： Four samples of Vibrio cholerae nucleic acid （non O1/non O139 group， 24-plex fluorescence real-time PCR） were detected from the anal swabs of 5 food poisoning patients before bacterial enrichment. Nine samples of patients detected five strains of Vibrio cholerae （non O1/non O139 group， national standard culture method） from their anal swabs after bacterial enrichment， including four samples that were initially screened positive by PCR technology. The compliance rate of the two methods was 80%. All samples did not detect Salmonella， Shigella， Vibrio parahaemolyticus， Escherichia coli， or Staphylococcus aureus. Conclusion： The 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology was used to detect 24 common pathogenic bacteria at the same time， which could effectively lock the poisoning pathogens. Combining it with national standard culture method can play a positive role in clinical treatment and rapid treatment of food poisoning， which is worthy of application and promotion.

Keywords： 24-plex fluorescence real-time PCR; culture method; food poisoning

食物中毒事件大多数是突发的，涉及人员较多，中毒机制复杂，致病因子较多，单靠现场流行病学调查较难推断中毒病原体，甚至现场没有线索无法判断中毒病原体，这种情况下只能把常见的多种致病菌都按照国标培养法流程进行增菌分离，该过程工作量大、操作烦琐、耗时长，无法及时为事件处置提供实验室依据，降低了事件处置效率，不利于临床救治。采用24重荧光real-time PCR检测技术快速筛检食物中毒病原菌，高效锁定病原菌，并与国标培养法相结合，可为及时进行事件处置和临床救治提供依据。

2022年清远市发生一起食物中毒事件，主要症状为腹泻、呕吐，接报后，应急小组赶赴现场开展流行病学调查和采样工作，采集样品送实验室进行检测。由于致病因子不明，而24重荧光real-time PCR技术同时可以检测沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌以及变形杆菌等24种病原体，故实验室直接采用24重荧光real-time PCR技术对5份症状比较严重的患者肛拭子进行初筛，以期能高效锁定中毒病原菌，提高事件处置效率，为临床救治赢得时间。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采集9份患者肛拭子样品，10份厨房环境样品，2份水样品，送实验室检测。

1.2 仪器与试剂

48位核酸提取仪（中国上海伯杰医疗科技有限公司）；ABI7500型real-time PCR 仪（美国ABI公司）；碱性蛋白胨水、3%碱性蛋白胨水、缓冲蛋白胨水、7.5%氯化钠肉汤、志贺氏菌增菌液、营养肉汤、弧菌显色平板、TCBS平板、4号平板、沙门菌显色平板、金黄色葡萄球菌显色平板、大肠菌显色平板，北京陆桥技术股份有限公司；生化鉴定试剂盒（批号：5110416），广东环凯生物技术有限公司；霍乱弧菌诊断血清O1群、O139（批号：20220101），宁波天润生物药业有限公司；核酸提取试剂（BG001B提取程序），上海伯杰医疗科技有限公司；24种腹泻病原体多重病原体核酸快速检测试剂盒（荧光PCR法，批号22051806/7），生凌医疗。

1.3 实验方法

1.3.1 24重荧光real-time PCR法

吸取200 μL样品按提取试剂要求进行提取，吸取5 μL提取好的样品核酸到扩增试剂，混匀离心后上PCR仪进行扩增（扩增升温程序：50 ℃保温 15 min，95 ℃保温 5 min，95 ℃保温3 s，55 ℃保温45 s，并在该阶段收集荧光信号，循环45次）。共检测沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌、结肠弯曲菌、产气荚膜杆菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、小肠耶尔森菌、肉毒杆菌、EPEC（bfp、escV）、轮状病毒A型、诺如病毒（GI型、GⅡ型）、肠道腺病毒、札如病毒、星状病毒以及腺病毒24种腹泻病原体。

1.3.2 培养法

按国家标准法检验程序[1-5]要求对食源性致病菌进行增菌培养、分离鉴定，采用24重荧光real-time PCR技术初筛病原菌并进行重点增菌培养[6-7]，同时将培养鉴定结果与24重荧real-time PCR检测结果进行比较。

2 结果与分析

采用24重荧光real-time PCR技术对5份患者样品进行初筛，其中有4份检出霍乱弧菌核酸，经霍乱弧菌核酸试剂盒（O1、O139型，PCR法）确定为非O1/非O139群霍乱弧菌；采用国标法对9份患者样品进行增菌培养，检出5株霍乱弧菌（非O1/非O139群）（经PCR技术初筛为阳性的样品4份以及阴性样品1份），两种方法检测结果相符率为80%。2份环境样品经国标培养法检出霍乱弧菌（非O1/非O139群），其余样品霍乱弧菌检测结果均为阴性。两法均未检出沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠埃希菌以及金黄色葡萄球菌。

2.1 24重荧光real-time PCR技术检出情况

样品中霍乱弧菌核酸扩增曲线见图1。有明显指数增长期即可判定为阳性，从图中可以看出，5份患者样品在增菌前直接用24重荧real-time PCR法检测，其中4份检出霍乱弧菌核酸，循环数≤36。

2.2 国标培养法检出情况

采用国标法对9份患者肛拭子样品、10份厨房环境样品、2份水样品进行病原菌检测，结果只有弧菌显色平板上可见蓝绿色菌落，TCBS平板上可见黄色菌落，4号平板可见中心灰色半透明可疑菌落。挑出可疑菌落进一步分离纯化，经革兰染色镜检、血清诊断、生化鉴定后确定为霍乱弧菌（非O1/非O139群）。

3 讨论与结论

本次食物中毒事件患者只出现了肠胃不适，没有其他明显症状，现场流调结果为致病因子暂不明确，因此实验室直接用24重荧光real-time PCR技术进行初筛，一次直接筛查24种病原体，整个过程仅用3 h就锁定中毒致病菌，对查明事件原因、减轻国标培养法工作量、确定临床救治方案发挥了重要作用。经国标培养法验证，两法符合率达80%，表明24重荧光real-time PCR检测结果具有较高的可信度，这与其他学者的研究结果一致[8]。该事件中有1份样品经24重荧光real-time PCR技术初筛为阴性，但经国标法增菌培养后检出霍乱弧菌（非O1/非O139群），这可能是因为增菌前该样品含有霍乱弧菌（非O1/非O139群）核酸量低于PCR技术检出限，建议后续检测时可先进行短期增菌后再应用多重real-time PCR技术初筛，避免假阴性结果。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种用于放大扩增特定的核酸片段的分子生物学技术，是生物体外的特殊核酸复制，只要能提取出核酸，就能用PCR技术加以放大，进行比对。PCR的最大特点是能将微量的核酸大幅增加。食物中毒事件涉及人员较多，且极为复杂，现场遗留的中毒病原体可能极其微量，食物中毒事件处置过程中快速明确中毒病原体是事件定性的关键。仅按照国标方法进行分离培养、生化鉴定等，耗时费力，难以满足高效处置事件的要求，因此建立一种准确、高效、灵敏、便捷的食物中毒病原体快筛方法意义重大[9]。近几年有关学者针对食物中毒快速检测方法进行了大量研究[10-12]，提出多重PCR技术是快速检测食物中毒病原体的有效方法[13-15]。

24重荧光real-time PCR技术设计了24种病原体的核酸引物，只要提取到微量核酸就可以同时排查24种病原体，具有筛查病原体多、灵敏度高、特异性强、速度快以及操作简单的优势[16-18]，其能在3～5 h锁定主要目标病原体，对常见的诺如病毒、轮状病毒等腹泻病原体也可以进行初筛，可以检测食物样品、环境样品、排泄物以及呕吐物等多种样品，适用于快速初筛食物中毒病原体。24重荧光real-time PCR技术应用前景广阔：①区、县级疾病预防控制中心基本都配备了P2实验室、PCR仪、提取仪等设备；②检验人员接受过PCR检测技术培训，可以熟练操作PCR仪，如果发生食物中毒事件，区、县实验室可以依靠自己的力量进行病原体初筛检测，有利于有效控制事件发展；③24种腹泻病原体核酸试剂盒商品化日益成熟，试剂耗材供应稳定，强大的物流运输完全可以保障试剂盒全程冷链监测方式送达客户手中，确保试剂盒质量。但该技术也存在以下不足：①基于PCR检测技术原理为体外基因片段的扩增，如果样本被污染，则可能造成假阳性结果；②对于细菌性感染事件，PCR检测技术还未被国家标准利用，使用PCR检测技术快速鎖定一种或者几种目标菌，依然要结合国家标准方法进行验证；③24种腹泻病原体PCR检测试剂盒价格昂贵，一些实验室经费预算不足，暂时无法普及开展。

综上所述，将24重荧光real-time PCR检测技术应用在食物中毒事件中有助于高效锁定病原体，可以与国家标准方法结合使用，应用前景较好，值得推广应用。

参考文献

[1]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验：GB 4789.4—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

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[3]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验：GB 4789.6—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验：GB 4789.7—2013[S].北京：中国标准出版社，2013.

[5]国家食品药品监督管理总局，国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品微生物学检验.金黄色葡萄球菌检验：GB 4789.10—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

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[7]肖东楼.霍乱防治手册[M].6版.北京：人民卫生出版社，2013.

[8]霍哲，任艷芳，徐俊，等.实时荧光定量PCR结合培养法在细菌学室间质量评价中的应用[J].食品安全质量检测学报，2021，12（4）：1519-1523.

[9]张艳芳，谢芝勋，曾婷婷，等.7种食源性致病菌GeXP多重PCR检测方法的建立及其应用[J].畜牧兽医学报，2020，51（10）：2536-2546.

[10]张伟，冯光伟，赵东阳，等.超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱串联质谱法快速检测食物中毒样品中的毒黄素[J].中国卫生检验杂志，2021，31（15）：1811-1813.