猪常温精液活力与密度检测操作中注意事项

解冰辉，李同川，段晓红，骆菲，王贵江，罗文学，马军红，张军辉

（河北省畜牧良种工作总站，河北石家庄 050061）

为了加快培养和选拔农业行业高技能人才，河北省每两年开展一次种猪繁殖职业技能竞赛，大赛有利于进一步提高家畜繁殖人员的业务素质，强化并提升技能，为加快农业农村现代化提供有力的人才支撑。 大赛结合生猪繁殖生产的实际情况，采取理论知识考试和现场技能操作考核相结合的形式，以全国大赛的比赛方案和评分细则为标准。 现笔者对技能考核中猪常温精液精子活力和密度检测操作步骤中容易出现的问题进行汇总。

1 使用的设备注意事项

1.1 恒温加热台

设置为37℃，打开开关，只显示当前实际温度，按下set 键显示设定温度，数字闪烁，按上下箭头键调到37℃， 再按下set 键进入工作状态。选手常犯错误：打开开关，看到显示的37℃就不设置了。 设置好了37℃，再按下set 键后发现显示的不是37℃， 以为设置错了又重新操作耽误时间。 忘记再按下set 键。

1.2 恒温水浴锅

设置为37℃，打开开关，显示屏显示两个温度，上面的ST：30：00 是设定温度（水浴锅关闭电源后，设定温度自动恢复出厂设置30℃，不保存上次设定温度，所以每次打开开关就显示设定温度30℃），下面的WD：☆☆是当前实际温度。直接按箭头键调到37℃， 每按一下向上箭头键增加1℃，每按一下向下箭头键减少0.1℃，完成温度设定后， 按下红色运行键进入工作状态，水浴锅最上边的红色加热指示灯亮，表明水浴锅开始加热，当水温达到设定温度时，加热指示灯自动灭。 选手常遇问题：不小心设置成了38℃，需要按向下箭头键10 次， 所以操作要谨慎小心。忘记按下红色运行键。 按下运行键后发现加热指示灯不亮以为操作出了问题，实际上是水温达到了37℃。

1.3 温度计

温度计保持竖直。 温度计的玻璃泡全部浸入水中，不要碰到容器底或壁，从立体的角度看玻璃泡应放在水中央位置。 读数时温度计的玻璃泡要继续留在水中，视线应与温度计水银面相平。 玻璃泡浸在水中稍候一会儿，示数稳定后再读数。

1.4 显微镜

旋转镜头转换器， 使低倍物镜对准载物台中央的通光孔，当听到“咔哒”声时，说明镜头位置调整到位。 将要观察的样品先移到通光孔位置，然后眼睛看着物镜，用粗动手轮调节载物台，缓慢上移近距离接近镜头但不要损坏到物镜，然后慢慢下移载物台的过程中看显示屏，当看到显示屏出现模糊图像时，再调节细动手轮，直至图像清晰为止，然后换成高倍物镜观察。

比赛使用的显微镜， 物镜有4 倍、10 倍、20倍，先用4 倍物镜观察再转换成10 倍物镜观察，因为使用了显示屏就不用考虑操作步骤中提到的200 倍了； 接通电源， 在显微镜底座上显示38℃，它代表载物台会自动加热到38℃，厂家设置好了不需要调整；显微镜最上面的显示屏开关是独立的， 与显微镜开关没有关系。 常犯错误：裁判助手事先接通电源，打开显示屏，显微镜下面的温度显示38℃， 选手到位后看到显示屏是亮的，温度也有显示，就认为显微镜是打开状态。载物台上移的时候看显示屏， 容易损坏物镜镜头。 接近精液的位置经常遇见类似杂质的东西，接着移动载物台就能找到，选手通常以为精子就在这个位置，上下微调就是找不到而浪费时间。

1.5 移液器

举例，取1 毫升精液放入小试管，手握移液器，拇指下压到第一道阻力时吸取精液取出的就是1 毫升， 如果再向下压死取的就大于1 毫升了。 慢慢吸入，吸取精液时手松开太快就吸不够1 毫升，因为吸头的一端太细，来不及吸入。放入小试管时，沿侧壁慢慢流入,如果手压太快精液迅速到达小试管底部反弹喷出。 移液器吸入精液后不可倒放不可平放，应尽快将精液放入小试管，防止精液倒流损坏移液器。 恢复移液器初始状态时， 调节移液器使其内部弹簧处于放松状态，如果调反了方向，过了极限从而造成移液器的损坏。

2 关于精液的摇匀

2.1 打开17℃精液保存箱，取出一瓶常温精液轻轻摇匀。 如果剧烈摇晃就会影响精子活力和畸形率，如果不摇匀，瓶内不同位置活力和密度会有差异，影响最终结果的判断。

2.2 取2700 微升3%氯化钠溶液和300 微升精液于小试管混匀，不摇匀，计数不准确，两个计数室误差超过5%则需要重做。 应该形成一个习惯，只要是精液，拿到手里第一件事就是轻轻摇匀。

3 关于取样

保持精液瓶与视线水平， 使其倾斜约45° ,微量移液器吸头深入液面下15～20 毫米处取样。多次实验数据表明，15 毫米处活力和密度是最高的。

4 关于血球计数板

4.1 确定计数的5 个中方格

计数板有两个计数室，每个计数室有9 个大方格，正中间是计数用的大方格，只有这个大方格由25 个中方格组成，每个中方格由16 个小方格组成，每个中方格边缘线是双线，取左上角-右上角-右下角-左下角-中间5 个中方格计数。

4.2 计数

5 个中方格按照固定顺序计数，避免丢失一格。计数原则：以精子头部为准，数上不数下，数左不数右。 意思是计数时看头部在哪，在计数的中方格以内都计数，在边缘双线内的：在上边缘双线和左边缘双线内计数，在下边缘双线和右边缘双线内不计数。 如果精子比较多，避免丢数或重复计数，在每一个小方格也使用这个原则。 计数另一计数室5 个中方格的精子数， 并记录数据。

4.3 计算精子密度

公式：密度=两个计数室中5 个中方格总精子数的平均数×5×10 （1 立方毫米）×1000 （1 毫升）×10 （稀释倍数）=平均数×50 万=平均数×0.005 亿=平均数÷200 亿。

解释：一个大方格长宽都是1 毫米，高为0.1毫米，体积为0.1 立方毫米。 平均数×5，为25 个中方格即一个大方格的精子数，即0.1 立方毫米内的精子数，×10 后为1 立方毫米内的精子数，1毫升等于1000 立方毫米，×1000 后为1 毫升的精子数，这个时候的数据是精液稀释后的，所以再×10（稀释倍数）后的数据为精液每毫升的精子数。 密度单位：亿个/毫升。

5 活力和密度结果要求

国标规定，活力小数点后保留一位，密度小数点后保留3 位。 原则：四舍六入五成双，遇见5时， 举例活力：65.25 修订为65.2；65.35 修订为65.4，去掉5 后末位为双数。

6 其他注意事项

6.1 佩戴乳胶手套并消毒。 保持手部干燥，向手套内吹一口气，让手套充分鼓起再佩戴。 用酒精喷雾对手消毒，避免喷在操作台上。

6.2 载玻片、盖玻片放到恒温加热台上预热，只预热载玻片或盖玻片或者把盖玻片放在载玻片上预热，都是不对的，要分开预热。

6.3 微量移液器吸取20 微升预热好的精液滴于载玻片上，加盖已预热的盖玻片，并无明显气泡。产生气泡的可能性：加盖盖玻片方式不对，要倾斜着放下盖玻片；移液器滴出精液后还用力下压就挤出气泡了。 有人把载玻片拿起来滴精液，一方面是载玻片离开了加热台影响了精液温度， 另一方面因为紧张手打哆嗦滴不好位置，在恒温台上滴相对稳定一些。

6.4 调整载物台，确定3 个不同视野，调整显微镜，视野清晰，准确评定不同视野下精子活力。精液只有一滴，还被压成薄薄一层，所以精子死的快，这就要求判断活力要快，另一方面比赛时间是有限制的。 常常有选手在此耗费时间，左思量右思量，对数据的判断犹豫不决。

6.5 取2700 微升3%氯化钠溶液和300 微升精液于小试管，混匀，吸取20 微升稀释后的精液置于血盖片边缘， 使精液依靠虹吸流入计数室，均匀充满，计数室内无气泡。 用同样方法在血细胞计数板另一侧计数室加样。 越是精细的动作越容易紧张，左手手肘支在操作台上，左手扶住移液器，右手滴精液，尽量避免手颤抖。 操作要稳要慢，充满计数室后立刻停止，否则误差太大。 如果发现有气泡，应该重新操作此步骤。