NOD样受体蛋白3炎症小体在多柔比星诱导心脏毒性中的意义

黄亚晓，何新雨，曾小娟，胡世娇，乔文伟，张锦

作者单位：1兰州大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；

2兰州大学第一医院心内科，甘肃 兰州730000

手术、放化疗、靶向治疗、免疫治疗等治疗方式使恶性肿瘤治疗取得了长足的进步，肿瘤病人的生存期也得到大幅延长。多柔比星（doxorubicin，DOX）是一种广谱的蒽环类抗生素。在抗肿瘤的同时也可导致剂量依赖性的心脏毒性，最终可能发展为充血性心力衰竭和死亡［1］。此外，DOX 使用周期长和年龄（如儿童）、糖尿病或心血管疾病（如高血压、高血脂或动脉粥样硬化）等更易导致这些并发症，吸烟、肥胖或不运动也会增加心脏毒性风险［2］。因此，仍然迫切需要确定新的药理靶点，以减轻多柔比星诱导心脏毒性（doxorubicin-induced cardiotoxicity， DIC）作用。作为感染和外部刺激的传感器，含有NOD 样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）炎症小体的核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族pyrin 结构域在各种疾病的病理过程中起着关键作用。有趣的是，降低NLRP3 炎症小体的活性可减轻DIC。因此，针对这一发现，我们回顾并梳理了目前关于NLRP3 炎症小体在DIC 中潜在意义的研究。

1 NLRP3炎症小体结构与功能

NLRP3 是一种模式识别受体（pattern recognition receptor， PRR），识别细菌和病毒性病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），但也识别与组织和细胞损伤有关的多种危险相关分子模式（damage-associated molecular patterns， DAMPs）。PAMP 或DAMP，或细胞因子如肿瘤坏死因子（tumournecrosis factor，TNF）和白细胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）可识别PRR 如Toll 样受体（toll-like receptor，TLR）、白细胞介素-1受体（interleukin-1 receptor， IL-1R）激活炎症小体［3］。NLPR3 炎症小体的激活需要两个阶段，首先，DAMPs 或PAMPs 识别TLR，激活核因子κB （nuclear factor kappa-B， NF-κB） 通路，导致NLRP3 和白细胞介素-1β 前体 （pro-Interleukin-1β， pro-IL-1β）和pro-IL-18 的产生。其次，由NLRP3 蛋白、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis- associated speck- like protein containing a CARD，ASC），和胱天蛋白酶-1 的前体（pro-caspase-1）组成 NLRP3 炎症小体，使pro-caspase-1 切割成活性形式的caspase-1， 进而pro-IL-1β 和pro-IL-18 形成生物活性IL-1β 和IL-18，诱导炎症反应［4］。激活的Caspase-1 识别和切割引起GSDMD 激活并在细胞膜中形成GSDMD 通道，引起细胞凋亡［5］。线粒体功能障碍及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，胞质钙超载、钾外流、氧化应激（oxidative stress，OS）和溶酶体损伤等均可诱导NLRP3炎症小体的激活和组装［6］。

2 NLRP3炎症小体在DIC中的作用

DOX 是一类抗癌药物，用于白血病、淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、小细胞肺癌和其他实体瘤等多种癌症的治疗。DOX 可插入DNA 双螺旋的碱基抑制DNA 和RNA 的合成，也可与DNA 反应并引发细胞凋亡。目前，研究人员认为DIC 的原因主要与线粒体功能障碍、ROS 产生、OS、炎症反应、细胞焦亡等相关［7-8］。因心肌细胞富含线粒体，缺乏抗氧化酶，可产生大量ROS，ROS 可激活NLRP3 及后续因子的释放，更易使心脏产生毒副作用。另一些研究证明，15 mg/kg 的DOX 足以建立心脏毒性小鼠模型［9］。NLRP3 炎症小体的活性被抑制改善了DOX 诱导小鼠或大鼠的左心室收缩功能障碍和心肌细胞死亡［10-11］。强调了NLRP3 炎症小体在DIC 中的重要作用。

NLRP3 炎症小体激活的两个阶段：（1）DAMPs或PAMPs 结合细胞膜上TLR，激活NF-κB 通路，导致NLRP3、pro-IL-1 和pro-IL-18 的产生或激活。（2）组装（NLRP3、ASC、pro-caspase-1）成NLRP3 炎症小体，进而pro-caspase-1 转化成生物活性形式的caspase-1，促进pro-IL-1β 和pro-IL-18，形成成熟体IL-1β和IL-18，诱导炎症反应。激活：线粒体功能障碍及ROS的产生、胞质钙超载、钾外流、OS和溶酶体损伤、DAMPs或PAMPs、IL-1β等。

NLRP3 炎症小体是一个复杂的调节蛋白网络，可启动炎症反应，越来越多的证据表明，在DIC的发展中，NLRP3 炎症小体的激活及后续炎症细胞因子的分泌起着核心作用。例如，Zhu 等［12］对小鼠腹腔注射DOX 后发现，空泡化心肌细胞显著增多及肌原纤维紊乱，这两者都是心脏损伤的标志。同时，检测血清和心脏组织中IL-1β 水平显著增加，并呈剂量依赖性，推测IL-1信号可能部分参与DOX 诱导的急性心脏损伤［12］。同样，Sauter等［13］在ASC、caspase-1 或NLRP3 缺陷的小鼠骨髓源性巨噬细胞中，DOX未能诱导IL-1β 的释放，这表明DOX 诱导的炎症是由NLRP3炎症小体介导的。另外研究表明，DOX 还可通过诱导TINCR（terminal differentiation-induced lnc RNA，TINCR）基因启动子区的H3K27 乙酰化并激活心肌细胞中的转录，增加了TINCR 的表达。通过胰岛素样生长因子ⅡmRNA 结合蛋白1（IGF2BP 1）增加mRNA 的稳定性，增强TINCR 上调NLRP3 的表达的作用，激活caspase-1 和GSDMD 途径［14］。MCC950（NLRP3 抑制剂）可使DOX 诱导小鼠和H9c2 细胞中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18 和GSDMD的表达水平降低，进而抑制细胞凋亡［15］。因此，DOX 诱导的心脏损伤与NLRP3炎症小体活化存在相关性。

机制上，ROS 可激活NLRP3 炎症小体。线粒体功能障碍可使ROS 产生增加，Catanzaro 等［16］发现，线粒体内DOX 的浓度达到50～100 μmol/L 时，可使ROS 产生增加。同样，在DOX 诱导的扩张性心肌病模型小鼠中，经DOX 治疗可激活调控动力相关蛋白1 进而上调NOX1［烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶1］和NOX4 的表达，诱导线粒体分裂，ROS 积聚，导致NLRP3 炎症小体通过caspase-1依赖性方式介导心肌细胞焦亡［17］。另一项研究也表明，DOX 诱导小鼠心肌和心肌细胞凋亡，同时ROS 过度产生，NLRP3、ASC 和caspase-1 p20 表达上调，以及心肌细胞中IL-1β分泌增加［18］。 此外，核因子红细胞2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）是参与细胞对ROS 反应的重要信号分子。DOX 可以通过激活Nrf2 信号通路以上调P-gp 表达来增加ROS［19］。并在DOX 诱导急性心脏毒性的心肌细胞观察到Nrf2 mRNA 和Nrf2 蛋白表达水平降低［20］。因此，NOX1、NOX4、Nrf2 可通过ROS-NLRP3在DIC中发挥一定的作用。

DOX还被证明通过抑制sirtuin家族的成员来干扰线粒体功能，sirtuiin 家族催化组蛋白和非组蛋白赖氨酸残基的脱乙酰化。DOX 治疗可以抑制小鼠心脏以及H9c2 和原代心肌细胞中SIRT3 的表达［21］。SIRT3 的过度表达减少了ROS 水平，保护了线粒体功能，并保护线粒体DNA 免受DOX 治疗的损伤［［22］。SIRT1 是另一个sirtuin 家族成员，一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，通过增强自噬和减少因缺氧诱导的细胞凋亡，对心肌细胞发挥保护作用［23］。DOX 抑制SIRT1 的表达。SIRT1 缺失会加重DOX 诱导的细胞毒性，并破坏线粒体功能［24］。而SIRT1 的过度表达抑制DOX 诱发的细胞凋亡和ROS 产生［25］。DOX 下调H9c2 细胞和小鼠心脏组织中的SIRT1 表达并激活NLRP3 炎症小体和增加硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein， TXNIP）水平，促进心肌细胞凋亡［26］。此外，DOX 诱导的H9c2 心肌细胞衰老依赖于硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）/NLRP3 炎症小体途径［27］。总之，sirtuins 可以调节线粒体功能，从而促进心肌细胞存活。这些实验确定了sirtuin作为DOX诱导的心脏毒性的潜在治疗靶点。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）具有调节细胞增殖、分化、凋亡等作用，由p38 MAPK 丝裂原活化蛋白激酶（p38 Mitogen-activated protein kinases， p38 MAPK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase， ERK）组成。DOX 治疗显著增加了小鼠TLR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α 和细胞信号蛋白（MyD88、p-P38 和p-JNK）的心脏表达［28］。在髓样分化蛋白1（MD-1）基因敲除小鼠中，Zhang 等［29］观察到，DOX 可加速心功能障碍和心肌损伤、促进细胞凋亡，可能通过激活TLR4/MAPKs/NF-κB 途径实现的。因此，DOX 还可作用于TLR4/MAPKs 进而导致NLRP3 激活致心脏损伤。尽管有令人信服的证据表明，在DOX 处理的小鼠中，抑制NLRP3 炎症小体的激活具有心脏保护作用，但独立于炎症小体NLRP3 活性也可能是对DOX 的保护作用的原因［30］。

总之，NLRP3 炎症小体通过诱导心肌细胞凋亡、焦亡和心肌炎症反应参与DIC的发生和发展，但具体机制目前尚不清楚。

3 抑制NLRP3对DIC防治的作用研究

近年来，有很多研究者发现使用某些天然化合物、药物、其他等可通过靶向多种途径中的一种或多种途径抑制NLRP3 炎症小体的激活，减轻DIC。见表1。

表1 关于天然化合物、药物、其他等通过抑制NLRP3炎症小体激活治疗DIC的总结

综上所述，大量研究证实了NLRP3 炎症小体在DOX 治疗引起细胞死亡和炎症反应中所起的核心作用。DOX 诱导的心脏炎症涉及多种途径，NLRP3的过度表达加重了DOX 诱导的心脏损伤。同时，NLRP3 炎症小体的下调有效地预防了DOX 引发的心脏毒性。因此，抑制NLRP3 炎症小体激活可能是防止DIC 的有效方法。然而，上述研究大多在细胞和动物模型上开展，缺少在人体内的研究，更缺乏临床随机对照试验的研究加以支持。此外，天然化合物、药物、其他等虽可改善DIC，但是我们期待临床试验进一步证实临床效果，寻找可为临床使用的易于获取的能抑制NLRP3 炎症小体的抗炎药物，从而改善DIC病人的预后。