基于临床指标-CT征象的列线图模型术前预测结直肠癌微卫星不稳定状态

卞雪莲,孙琦,王咪,董瀚韵,戴晓晓,吴永友,张力元,范国华,陈光强

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)目前是全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤,且呈现增长趋势[1]。微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)是CRC致癌途径相关的分子机制之一,具有特殊的临床意义:首先,MSI检测可作为林奇综合征(Lynch syndrome,LS)的初筛方法;其次,对于早期CRC,尤其是II期病变,MSI状态是一个积极的预后因素;最后,MSI状态的CRC患者可获益于免疫治疗,但不能从以氟尿嘧啶为基础药物的化疗方案中获益[2]。所以检测MSI状态对指导CRC患者的诊疗具有一定的临床价值。

MSI检测通常采用有创的方法(如活检)来获取肿瘤的病理组织,耗时长、花费大且技术要求高,而且活检只能获取病灶极小部分的样本,难以全面反映肿瘤的微卫星状态[3]。所以,临床上更希望有一种无创的、经济有效的术前预测CRC患者肿瘤MSI状态的方法。CT增强扫描是临床上常用的一种诊断CRC的无创性检查方法,能够判断病灶局部及全身情况,有助于疾病诊断及治疗方案的选择。因此,本研究中通过分析基于CT增强征象联合临床指标建立的列线图模型在术前预测CRC患者MSI状态中的可行性,旨在术前无创性预测CRC的MSI状态,从而有助于CRC患者的诊疗及预后评估。

材料与方法

1.研究对象

回顾性连续搜集2016年1月-2022年12月在本院就诊且符合本研究中纳入标准的504例CRC患者的病例资料。纳入标准:①经手术病理证实为结直肠腺癌;②术前2周内接受Philips 256 CT机腹盆部平扫及三期(动脉期、静脉期、延迟期)增强检查;③采用免疫组化方法获得了MSI或微卫星稳定(microsa-tellite stability,MSS)状态的结果。排除标准:①临床资料不完整(n=24);②CT图像上无法识别肿瘤或图像质量不佳(n=53);③病理证实为非结肠腺癌或合并其它癌(n=39);④术前接受过放疗、化疗和生物治疗等任何抗癌治疗(n=30);⑤出现肠套叠、肠穿孔等并发症(n=11)。

最终,共纳入符合要求的347例患者(MSI组71例,MSS组276例),按照7︰3的比例随机分为训练集243例(MSI组50例、MSS组193例)和验证集104例(MSI组21例、MSS组83例)。

本研究经本院伦理委员会批准。

2.临床资料

通过回顾CRC患者的电子病例,搜集术前1周内的临床信息,包括一般信息:年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤家族史、高血压史和糖尿病史;记录各项实验室指标的值,包括血清癌胚抗原(CEA)、血清糖类抗原19-9(CA199)、白细胞(WBC)、中性粒细胞(NE)、淋巴细胞(LYM)、血小板(PLT)、C反应蛋白(CRP)和白蛋白(ALB),并计算中性粒细胞与淋巴细胞计数的比值(NLR=NE/LYM)及系统免疫炎症指数值[SII=PLT×(NE/LYM)]。

3.CT图像采集和分析

使用Philips 256 CT机进行腹部和盆腔CT平扫和三期增强扫描。检查前患者禁食8 h以上,扫描前约2 h口服阴性对比剂(0.9%生理盐水400 mL+20%甘露醇100 mL),总量约1500 mL。CT扫描参数:管电压120 kV,管电流自动调制技术(150～500 mA),探测器宽度128×0.625 mm,螺距0.99,层厚5 mm,层间距5 mm,0.75 s/r,视野250 mm×250 mm,矩阵512×512。腹盆部CT平扫后,注射80～100 mL碘海醇(300 mg I/mL),注射流率3.0～4.0 mL/s,分别于给药后25～35、65～80及210 s启动动脉期、门静脉期及延迟期增强扫描。

所有患者CT图像由一位具有3年以上腹部影像诊断经验的医师进行分析,并由两位高年资影像科主任医师在场进行指导,意见不一致时经协商达成一致意见。三位医师对CRC患者的病理信息均不知情,定量指标均测量3次取平均值,主要分析/测量以下CT征象/参数。①临床T(clinical T,cT)分期和临床N(clinical N,cN)分期:根据第八版的AJCC标准进行评估;②病变部位:右半结肠包括近端 2/3的横结肠、升结肠和盲肠;左半结肠或直肠包括远端1/3横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠[4];③病变肠管长度;④病变肠管最厚径;⑤强化方式:强化均匀的标准为病灶在门静脉期图像上的最大与最小强化值的差值≤10 HU;反之则为不均匀强化[5];⑥测量病灶在各期图像上的CT值并计算相对CT值(contrast ratio,CR):观察平扫及三期增强图像,选取肿瘤最大层面、肿瘤边界最清晰的期相,在病灶内勾画ROI,避开肿瘤边缘约2 mm[6],并注意避开脂肪、气体、肠内容物和钙化等;并对同层面腹主动脉或其大分支进行ROI的勾画,避开血管壁及斑块。ROI通过复制粘贴方式保证各期图像上ROI的大小和位置一致。测量各ROI的CT值并计算CR(病变CT值与同层面腹主动脉或其分支CT值的比值[7]),包括平扫(PCR)、动脉期(ACR)、静脉期(VCR)和延迟期相对CT值(DCR)。

4.MSI状态的检测

在垂直于肠壁长轴的肿瘤最大层面,于病灶组织内取材。MSI是由4种DNA错配修复蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)功能缺陷导致的,通过免疫组化方法观察DNA错配修复蛋白的缺失情况,在4种错配修复蛋白中,一种或多种蛋白染色阴性即判定为MSI状态,4种蛋白均为阳性则为MSS状态[8]。

5.统计分析

使用SPSS 26.0及R4.3.0软件进行统计分析。连续变量先采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验,符合正态分布的数据以均数±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验;非正态分布的数据以M(Q1,Q3)表示,两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。分类变量以例数(百分比)表示,两组间比较采用χ2检验。将单因素分析结果显示组间差异有统计学意义的指标纳入多因素二元logistic回归分析,得到与CRC患者MSI状态相关的独立危险因素。通过R软件进行列线图、ROC曲线、校准曲线及决策曲线(decision curve analysis,DCA)的绘制和分析,采用Hosmer-Lemeshow检验评价列线图模型的拟合优度。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.患者临床资料

共纳入347例CRC患者,年龄28～90岁,中位年龄66岁;男200例,女147例。MSI组与MSS组及训练集与验证集之间临床资料的比较结果见表1。

表1 MSI组与MSS组及训练集与验证集之间临床资料的比较结果

MSI组的PLT及SII水平高于MSS组,差异有统计学意义(P<0.05);两组之间其它临床资料的差异均无统计学意义(P>0.05)。

训练集和验证集中MSI的出现率分别为20.58%(50/243)和20.19%(21/104),差异无统计学意义(χ2=0.044,P= 0.834)。两组之间各项临床资料的差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.CT征象分析

MSI组与MSS组及训练集与验证集之间CT征象/指标值的比较结果见表2。

表2 MSI组与MSS组及训练集与验证集之间CT征象的比较结果

相比于MSS组,MSI组中CRC更好发于右半结肠,强化更不均匀,且PCR、ACR、VCR及DCR值均较低,上述征象/指标在两组间的差异均有统计学意义(P<0.05);其它CT征象,包括cT分期、cN分期、病变肠管长度及病变肠管最厚径,在两组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。

训练集与验证集之间各项CT征象/指标值的差异均无统计学意义(P>0.05)。

3.列线图模型的建立

将组间差异有统计学意义的变量,包括PLT、SII、病变部位,强化方式、PCR、ACR、VCR及DCR,纳入多因素二元logistic回归分析,结果显示PLT、SII、病变部位、强化方式和ACR是MSI的独立危险因素(P均<0.05);PLT及SII每增加100×109/L,预后不良的风险分别增加1.458、1.051倍;PCR、ACR、VCR及DCR每增加0.1,预后不良的风险分别降低0.209、0.606、0.406和0.141倍,详见表3。基于上述5个临床和CT征象,构建列线图(图1)。

图1 基于回归分析筛选的临床和CT特征构建的预测CRC患者MSI状态的列线图。 图2 列线图模型的ROC曲线,训练集和验证集中的AUC分别为0.765和0.783,表明该模型在预测CRC患者MSI状态方面具有较高的效能。 图3 列线图模型的校准曲线,显示模型预测MSI状态的概率和实际概率之间具有良好的一致性。a)训练集的校准曲线;b)验证集的校准曲线。 图4 列线图模型的决策曲线,显示在合理的风险阈值概率范围内,列线图模型在区分CRC患者MSI状态方面具有较高的临床净效益。

表3 临床-CT征象的多因素二元logistic回归分析

4.列线图模型效能的评估

绘制列线图模型的ROC曲线(图2),在训练集和验证集中AUC分别为0.765(95%CI:0.687～0.843)和0.783(95%CI:0.642～0.923),敏感度分别为0.760和0.762,特异度分别为0.684和0.819。校准曲线显示列线图模型在训练集和验证集中预测MSI状态的概率与实际概率之间有着良好的一致性(图3),Hosmer-Lemeshow检验结果显示其差异均无统计学意义(P>0.05)。DCA结果显示在合理的阈值概率范围内,列线图模型在区分CRC患者MSI和MSS状态方面具有较高的临床净获益率(图4)。将本研究中构建的列线图模型应用于建模人群之外的一例CRC患者,显示本模型预测的MSI结果与病理结果相符合(图5)。

图5 女,80岁,结肠癌患者。a)增强CT动脉期横轴面图像,测量结肠壁肿瘤病灶的ACR约为0.20;b)增强CT静脉期冠状面图像,显示肿瘤病灶位于右半结肠,强化不均匀。此例患者术前1周内实验室检查结果显示PLT为245.0×109/L、NE为9.0×109/L、LYM为0.8×109/L,计算得出SII为2756.3×109/L,参照列线图模型,5项得分分别约为61.5、15.0、22.7、19.0和30.2,总得分为148.4,对应的MSI发生概率为71.2%;c)此例患者术后PMS2免疫组化染色图像(×100),可见细胞核未见棕色染色,即染色阴性,提示为MSI状态。

讨 论

微卫星是指基因组中以少数几个核苷酸(一般为1～6个)为单位串联重复的DNA序列。正常组织中存在DNA错配修复系统,最常见的DNA错配修复基因是MLH1、MSH2、MSH6和PMS2,当任一DNA错配修复基因发生突变,或出现MLH1启动子高甲基化,可导致错误的微卫星序列累积,称为MSI[9]。MSI检测通常通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、免疫组化和DNA测序等方法。PCR及DNA测序检查技术因其花费大、耗时长,难以全面应用于临床;免疫组化检测花费小、耗时短且简单易行,是我国临床检测微卫星状态的基本推荐[10]。但上述方法均为有创检测,且只能获取病灶极小部分的样本,难以反映全肿瘤的微卫星状态。因此,临床上需要一种简单易行的术前预测CRC患者MSI状态的方法。

本研究结果显示,在纳入的临床指标中,PLT和SII与CRC患者MSI状态密切相关。PLT除了止血方面的重要功能外,还是重要的炎症指标,SII是近年来提出的一种基于NE、LYM和PLT的综合性指标,能更好地反映机体的炎症反应状态[11]。已证实慢性炎症与肿瘤的发生发展、复发转移和免疫逃逸等关键环节密切相关,机体的炎症与免疫水平可以通过炎症指标来反映,且炎症指标通常通过血常规及血生化检查获取,是临床上对CRC患者常规进行且经济、相对无创的检测指标[12]。本研究中MSI组的PLT水平高于MSS组,这与既往的研究结果一致[13-14],且MSI组具有更高的SII,表明MSI状态的CRC患者可能具有更强的炎症反应,de Smedt等[15]的研究结果也支持本文观点。

本研究结果显示,在纳入的CT征象中,病变部位、强化方式和ACR与CRC患者的MSI状态密切相关。MSI更易发生于右半结肠,这与既往研究结果一致[16-17]。目前,增强CT强化特征用于评估CRC患者MSI状态的研究较少。增强CT扫描是基于不同肿瘤新生血管的形成而产生不同的血流动力学改变,从而可对病灶进行定性分析[18];但是,病灶的CT值受多种因素的影响,如患者生理因素、操作者因素及设备因素等[19],为了降低这些因素对病灶定性分析的影响,本文运用了各期CR值即病变与同层腹主动脉或其分支的CT值比值,使CT值标准化,更为准确的评估CRC患者的MSI状态,本研究结果显示MSI组病灶的ACR低于MSS组,且病灶强化更不均匀,这可能与肿瘤内部黏液及坏死等成分相关,Greenson等[20]的研究结果亦佐证了本研究的结果。

列线图能够整合多种危险因素,实现对患者的个性化风险预测,已经广泛用于多种肿瘤的预测[21-22]。但目前构建列线图模型术前预测CRC患者MSI状态的研究较少。本研究将筛选出的临床和CT征象,包括PLT、SII、病变部位、强化方式及ACR共5个指标,用于构建列线图模型,对模型的预测效能进行了多维度的分析,结果均显示其具有较好的预测效能、预测准确性及临床实用性,为术前预测CRC患者MSI状态提供了一种简单且直观的指导工具。

本研究存在以下局限性:首先,本研究为单中心回顾性研究,虽然列线图模型具有较好的预测效能,但仍需要多中心、大样本和前瞻性的研究来进一步验证。第二,本研究推测MSI组病灶的ACR低于MSS组且MSI组病灶强化更不均匀可能与肿瘤内部黏液及坏死等成分相关,但未能结合术后病理检查进一步研究证实。第三,本研究分析的CT征象,如cT、cN分期、病变部位、病变肠管长度、病变肠管最厚径、强化方式和各期CR值,在一定程度上受到放射科医师的经验和主观因素的影响。

总之,PLT、SII、病变部位、强化方式和ACR是预测CRC患者MSI状态的独立危险因素,基于上述临床和CT征象构建的列线图模型具有良好的预测效能,这对今后的临床工作有着十分重要的意义,可作为术前预测CRC患者MSI状态的辅助工具,能够协助临床制订CRC患者的治疗策略和评估患者预后。