粪便差异菌群、代谢物联合弥散张量成像对早产儿脑白质损伤的诊断价值*

刘 玲,罗 晗,李银珊,李承燕,敖 当,林少珠

(广东医科大学附属医院儿科,广东湛江 524000)

由于新生儿重症监护病房的技术不断提高,早产儿数目每年都在不断增加,存活的早产儿患弥漫性脑白质损伤(white matter injury,WMI)和神经发育不良的风险较高[1]。WMI是早产儿脑损伤的主要表现形式,多发生在胎龄<32周白质发育未成熟的早产儿,是造成慢性神经系统发育不良的主要原因[2-3]。WMI可引起脑性瘫痪、癫痫、认知障碍、语言及视觉障碍[4-5]。

弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)是一种新的MRI成像技术,能够可视化白质结构,评估白质纤维髓鞘化程度,对大脑皮层的微观结构变化更敏感[6]。对于早产儿WMI来说,DTI是目前唯一可用于研究白质纤维的无创技术。本课题组前期研究也发现,DTI能够早期量化早产儿的WMI,即FA值的降低和ADC值的升高能反映神经纤维束的发育和WMI的程度。

肠道菌群的平衡是维持肠道功能和机体稳态的关键,肠道菌群与宿主之间的相互作用是当前的热点。然而,肠道菌群的组成和多样性是不稳定的,极易受到食物、生活环境、药物、疾病,尤其是抗生素的影响[7]。微生物-肠-脑轴在神经系统疾病中起着至关重要的作用。

目前,MRI及超声可检测的非囊性WMI的比例较低,轻、中度WMI患儿的早期诊断仍是一大挑战,与WMI相关的潜在的微生物学标志物尚未被确定。本研究旨在使用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线探讨粪便肠道菌群、LC-MS/MS代谢组学及DTI联合诊断WMI的灵敏度和特异度,寻找诊断WMI的生物学标志物,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2022年4—12月本院收治的71例早产儿为研究对象。纳入标准:(1)出生胎龄<32周;(2)出生体重<1 500 g;(3)入院日龄≤24 h;(4)家属签署知情同意书。排除标准:(1)死亡;(2)住院期间因故未能完成头颅MRI+DTI检查;(3)合并先天性染色体异常或遗传代谢病者;(4)先天性大脑畸形;(5)各种原因造成图像不能分析;(6)已使用微生态制剂。本研究经医院机构审查伦理委员会批准(PJ2021-097)。

1.2 方法

1.2.1粪便收集与保存

分别采集研究对象出生后24 h内及出生后14、28 d粪便标本,取标本时使用无菌棉拭子从粪便的3个不同位置采集,每管约0.2 g(黄豆大小),贮存于-80 ℃冰箱保存至送检。

1.2.2DNA提取、PCR扩增及Illumina Miseq测序

根据E.Z.N.A.®soil DNA kit(美国Omega Bio-tek公司)说明书进行微生物群落总基因组DNA抽提,使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA的质量,使用NanoDrop2000(美国Thermo Scientific公司)测定DNA浓度和纯度。以上述提取的DNA为模板,使用携带Barcode序列的上游引物338(正向:5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和下游引物806(反向:5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)[8]对16S rRNA基因V3～V4可变区进行PCR扩增。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

玛丽的“本我”和“超我”正是处于这样一种博弈的循环中，“本我”已经千疮百孔，“超我”又是面目全非。正是因为玛丽那无处发泄的“本我”，“超我”处于极度的崩溃状态。

1.2.3高通量测序数据分析

使用CCA分析临床指标对肠道菌群结构的影响,采用ROC曲线分析诊断效能。

1.2.4LC-MS/MS分析

使用超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱UHPLC-Q Exactive HF-X系统(美国Thermo Scientific公司),预处理后的数据上传美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com)进行数据分析。

1.2.5MRI+DTI检查及图像处理

MRI检查采用3.0T磁共振成像仪(美国GE公司)扫描对所有研究对象头部实施MRI扫描。常规MRI扫描序列包括:T1WI轴位(TR 2 849 ms/TE 30 ms)及矢状位(TR 3 266 ms/TE 38 ms)、T2WI(TR 5 454 ms/TE 92 ms)及T2WI FLAIR(TR 8 500 ms/TE 90 ms)轴位成像。轴位扫描序列均以听眦线为扫描基线,层厚为5 mm,层间距为1 mm,FOV=20×20。矢状位扫描层厚5.0 mm,层间距0.5 mm,FOV=20×20;DWI及DTI扫描采用单次激发平面回波成像(EPI)序列,DWI扫描b值为0,1 000 s/mm2,FOV=20×20;DTI扫描b值为1 000 s/mm2,TR 3 000 ms/TE minimum,层厚5.0 mm,层间距1.0 mm,FOV=20×20,弥散梯度方向采用非同一直线上的25个方向。

利用FLnctool功能软件(美国GE公司)对DTI原始弥散图像进行后处理得到彩色FA图。感兴趣区(region of interest,ROI)在T2WI上选定,测量的8个ROI区域分别为额叶白质、顶叶白质、枕叶白质、侧脑室旁白质、内囊前肢、内囊后肢、胼胝体膝部、胼胝体压部。

1.2.6影像学结果分析

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组一般资料比较

各组一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 各组一般资料比较

2.2 各组ADC和FA值比较

轻度WMI组胼胝体压部ADC值较非WMI组升高,中重度WMI组枕叶白质、脑室旁白质、胼胝体膝部和压部ADC值较非WMI组升高(P<0.05)。轻度WMI组额叶白质、胼胝体压部FA值较中重度WMI组升高,中重度WMI组额叶白质、内囊后肢、胼胝体压部FA值较非WMI组降低(P<0.05),见图1。

A:轻度WMI组、中重度WMI组与非WMI组各ROI的ADC值比较;B:轻度WMI组、中重度WMI组与非WMI组各ROI的FA值比较;①:额叶白质;②:顶叶白质;③:枕叶白质;④:脑室旁白质;⑤:胼胝体膝部;⑥:内囊前肢;⑦:内囊后肢;⑧:胼胝体压部;a:P<0.05。

2.3 DTI值和肠道菌群结构的相关性

CCA分析结果显示,顶叶白质、枕叶白质及胼胝体压部的ADC值与菌群结构相关(P<0.05),其中胼胝体压部ADC值的r2值最大(r2=0.230 2,P=0.001),胼胝体压部与菌群结构相关性较大。此外,额叶白质、枕叶白质、胼胝体膝部和压部的FA值与菌群结构相关,其中枕叶白质的FA值r2值最大(r2=0.291 0,P=0.001),见图2。

A:枕叶白质和胼胝体压部的ADC值明显影响肠道菌群组成;B:枕叶白质、顶叶白质及内囊前肢FA值明显影响肠道菌群组成。

2.4 肠道菌群对WMI的诊断价值分析

属水平诊断WMI的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.88(95%CI:0.74～<1.00)。每个变量的贡献用变量的重要性得分来表示,葡萄球菌属(g_Staphylococcus)的得分最高,达5.692 56分,见图3。

A:ROC曲线(属水平);B:物种重要性排序图。

2.5 差异代谢物对WMI的预测能力

ROC曲线分析结果显示,在区分WMI与非WMI时,几种代谢物具有高灵敏度和特异度,WMI组和非WMI组AUC前3的代谢物分别是7-Methylhypoxanthine、Gly Gly Leu和2-Aminobenzylstatine。WMI1和非WMI1差异代谢物集诊断WMI的AUC为0.98(95%CI:0.96～0.99),见图4。

A:AUC最高的前3个代谢物的ROC曲线;B:WMI1 vs. 非WMI1代谢物集的ROC曲线。

2.6 差异菌群、代谢物及DTI联合对诊断WMI的预测能力

ROC曲线分析结果显示,在区分WMI与非WMI时,侧脑室旁白质和胼胝体压部FA值诊断WMI的AUC为0.74(95%CI:0.56～0.92)。差异菌群和代谢物指标联合诊断WMI的AUC为0.94(95%CI:0.86～<1.00)。差异菌群、代谢物联合FA值诊断WMI的AUC为0.98(95%CI:0.93～<1.00)。每个变量的贡献用变量的重要性得分来表示,Cholic Acid的得分最高,为5.453分,N-Docosahexaenoyl Cysteine得分为5.166分,g_Staphylococcus得分为5.159,见图5。

A:指标重要性排序图;B:FA值诊断WMI的ROC曲线;C:差异菌群、代谢物联合诊断WMI的ROC曲线;D:差异菌群、代谢物和FA值联合诊断WMI的ROC曲线。

3 讨 论

肠道菌群的作用受得越来越多的关注,肠道菌群失调与糖尿病、代谢综合征、非酒精性脂肪性肝病等代谢疾病,甚至与阿尔茨海默病、抑郁症等神经精神疾病有关[10-11]。WMI是与早产相关的常见并发症之一,是迄今为止早产儿脑损伤最常见的类型,50%以上发生在极低出生体重儿[12-13],然而目前WMI的早期诊断仍有挑战。本研究评估使用粪便16S rRNA基因测序、代谢组学及DTI联合指标对诊断WMI的预测能力。

肠道菌群多样性的减少及肠道微生物种类、数量、比例和位置的改变被称为菌群失调,在多种疾病的发病机制中起着重要作用[14-15]。早产儿肠道中潜在致病菌的定植增加,会使菌群多样性减少[16]。在过去的十年里,越来越多的学者认识到肠道菌群对大脑功能的重要性及其在神经系统疾病中的作用,甚至可能作为影响大脑发育的生物学标志物[17-18]。有研究发现,克雷伯杆菌属在肠道的过度生长可高度预测脑损伤[19]。本研究在属水平物种重要性得分排序中,葡萄球菌属得分最高,可能是WMI早期诊断的潜在微生物。葡萄球菌属作为潜在有害的肠道细菌,ZHANG等[20]研究发现其丰度与血清总胆红素水平呈正相关。YOU等[14]研究发现,创伤性脑损伤引起肠道菌群失调后会改变胆汁酸分布而导致胃肠功能障碍,而葡萄球菌属可能是导致胆汁酸代谢变化的主要菌群。

本研究通过ROC曲线分析发现可能的生物标志物,从而将WMI粪便标本与非WMI组标本区分开来,结果显示,7-Methylhypoxanthine、Gly Gly Leu和2-Aminobenzylstatine可作为诊断WMI的高灵敏度和高特异度的代谢物。7-Methylhypoxanthine属于嘌呤和嘌呤衍生物,2-Aminobenzylstatine属于羧酸及其衍生物,二者在WMI组水平降低。Cholic Acid属于胆汁酸、醇及其衍生物,参与初级胆汁酸生物合成[21]。葡萄球菌属可能通过下调Cholic Acid和Allocholic Acid等代谢物,影响胆汁酸生物合成,从而引起WMI。然而,这些代谢物对大脑发育的影响尚未见公开报道,其功能需要进一步的研究探讨。

DTI是目前唯一量化早产儿脑白质发育和损伤的方法,它可以识别MRI无法筛查的损伤[22]。本研究发现,在WMI组中,脑髓鞘形成延迟,尤其以侧脑室旁白质和胼胝体压部表现最明显,二者ADC值增高及FA值降低可能是早产儿发生WMI的早期重要标志。本研究还发现,早产儿WMI的发生率为32.3%,中重度WMI的发生率为15.4%,这与GANO等[23]的研究一致,但本研究早产儿胎龄和出生体重更小。

本研究选取的ROI为双侧额部白质、顶叶白质、枕叶白质、侧脑室旁白质、内囊前后肢、胼胝体膝部和压部,包括外周白质和深部白质,这些区域是WMI最常见的位置。胼胝体和内囊位于脑组织中心和深部白质,额叶、顶叶和枕叶白质分别位于周围脑组织的前、中、后,分析上述ROI影像学变化,可以初步了解早产儿白质结构的整体特征。FA值由神经纤维密度、含水量、髓鞘形成和纤维一致性来决定,多项研究发现,早产儿低FA值和神经系统发育异常有关[13,24]。本研究发现,根据胼胝体压部的ADC值和FA值,可以很好地判断新生儿WMI及损伤的程度。连接左右大脑皮层并高度整合高级运动中心和认知功能的胼胝体,一旦被破坏,就会导致双侧大脑半球连接断开。MALAVOLTI等[25]研究发现,当校正年龄为18个月时,胼胝体FA值降低与运动发育延迟有关。GANO等[23]研究发现,内囊损伤可导致定向障碍、构音障碍、记忆障碍、语言障碍、行为改变等。中重度WMI组内囊后肢的FA值较非WMI组明显降低。

综上所述,本研究首次将早产儿的肠道菌群、代谢物和脑白质结构相结合,并探讨这些因素对WMI的诊断价值,结果扩展了现有的关于微生物-肠-脑轴的知识,表明特征性肠道菌群、差异代谢物和DTI在很大程度上有助于区分WMI和非WMI,可以作为诊断和治疗的潜在靶点。但本研究仍有局限性:(1)相对较小的样本量,未来需要扩大样本量;(2)因为不可控力因素影响,研究对象出院后无法顺利完成随访;(3)本研究是单中心研究,这些发现可能不适用于其他地区,需要前瞻性、多中心研究来验证该结论。