高原寒冷环境猪腹部肠管火器贯通伤后弹道细菌变化及药敏分析

屈金权,李佳佳,杨欣悦,孙 赳,梁飞行,宋来阳,靳向辉,刘江伟

1.石河子大学医学院,新疆 石河子 832000; 2.新疆军区总医院新疆特殊环境医学重点实验室,乌鲁木齐 830000; 3.新疆公安厅特警总队训练基地,乌鲁木齐 830000

高原是指海拔高于2500 m的地区,多位于我国西部,其具有低压、低氧、寒冷等特点。高原地区发生火器伤后较平原地区对机体的损伤更加严重[1]。腹部在火器伤受伤部位中占比高[2-3],易发生腹腔出血以及严重感染导致死亡[4]。高原地区环境恶劣,救治相关设施落后及运输不便,均会导致高原寒冷地区腹部火器伤的救治更加困难[5]。目前高原地区火器伤的研究较少,且多集中于四肢及颅脑损伤,其伤道细菌学研究表明高原地区细菌生长缓慢,感染发生时间较平原地区晚[6]。但对于高原寒冷环境腹部肠管火器贯通伤后弹道细菌学的研究尚未见报道。高原寒冷环境腹部肠管火器贯通伤后大量肠道细菌随肠液涌入弹道,此时弹道入口及出口的感染时限是否较平原地区晚,细菌繁殖情况以及造成感染的细菌种类和药敏情况均是此类创伤救治时所需参考的重要内容。本研究在高原寒冷环境腹部肠管火器贯通伤猪模型建立的基础上通过观察实验猪的弹道情况,采集弹道组织细菌培养计数,分离纯化细菌进行药敏实验,为高原寒冷环境腹部肠管火器贯通伤的清创救治时限、抗生素的应用提供理论基础。

材料与方法

1 实验动物

普通清洁级雄性长白仔猪20只,2～3个月龄,体重30～35 kg,购于新疆泰昆农牧科技有限责任公司,检疫合格证明(NO.9001068323);实验猪送达后将其预饲于新疆军区总医院动物实验科大型动物饲养间[SYXK(军)2017-0049],环境温度(26.3±3.6)℃,相对湿度(46±18)%。本实验经新疆军区总医院医学伦理委员会批准(IACUC-DWLL20190314),实验过程符合动物福利3R原则。

2 主要试剂与仪器

硫酸阿托品(天津金耀,批号:2205101);盐酸氯胺酮注射液(江苏恒瑞,批号:11020BL);质谱样品处理机制溶液[梅里埃诊断产品(上海)有限公司,法国;批号1009574160];哥伦比亚血琼脂平板(常德比克曼生物科技有限公司,批号20230115);MH(Mueller-Hinton)琼脂培养基(江门市凯林贸易有限公司,中国;批号230204);药敏试纸直径为6 mm,规格为:氨苄西林(10 μg/片)、青霉素(10 μg/片)、亚胺培南(10 μg/片)、四环素(30 μg/片)、头孢他啶(30 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、阿奇霉素(15 μg/片)、庆大霉素(120 μg/片),上述产品均购自于常德比克曼生物科技有限公司(批号20221216);全自动微生物质谱检测系统(VITEK MS,bioMerieux,法国);恒温培养箱(宁波江南仪器厂);西北特殊环境人工实验舱(贵州风雷)。

3 实验方法

3.1模型建立 实验猪送达后,平原常温环境适应性饲养3～5 d,按照随机数字法将20只实验猪分为高原寒冷组(HC组)及平原常温组(LN组),每组10只。HC组模型:将实验猪放置于西北特殊环境人工实验舱内,调节实验舱海拔高度6 000 m[7](大气压47.33 kPa,空气氧分压为9.87 kPa),温度10 ℃,相对空气湿度20%～25 %,达到6 000 m海拔高度后饲养48 h,致伤前12 h禁食,6 h禁水,其余时间自由食水。暴露完成后立即将实验猪置于靶场。使用0.05 %硫酸阿托品注射液0.04 mg/kg+5%盐酸氯胺酮注射液20 mg/kg对猪耳后颈部肌肉注射麻醉,将猪呈肢体下垂的“悬空站立位”悬吊于靶场铁架上,暴露右侧腹部,于髂前上棘前方3 cm,腹中线靠背侧3 cm交界处标记射击点,用手枪距离实验猪约2 m处瞄准射击标记点,完成造模。LN组将实验猪放置于海拔800 m[8](实验室所在地乌鲁木齐海拔,大气压89.87 kPa,空气氧分压为18.8 kPa),温度25 ℃,相对空气湿度20%～25 %的环境中48 h,按上诉相同方法建模。模型建立成功后取下实验猪简单包扎后由救护车转运回实验室,HC组与LN组均放置于常温环境(海拔800 m,温度25 ℃,相对空气湿度20%～25 %)中观察。体温采集使用水银温度计插入猪肛门深度约5 cm测肛温5 min读数。

3.2细菌培养及鉴定 分别在2、4、8、12、24 h时间点使用无菌组织剪剪取距皮肤约1 cm的弹道内部组织约0.1 g,称重后置于研钵中加入无菌生理盐水1 mL充分研磨后制成原液,再将原液使用无菌生理盐水定比稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的接种液。将原液及各浓度接种液取0.1 mL均匀涂布于血琼脂平板上,将平板倒置于37 ℃恒温培养箱培养24 h,取出培养皿选择菌落数在30～300的平板计数,菌落表现一致的为相同细菌,组织细菌含量计算方法为:(培养皿细菌计数×10×稀释倍数)/组织重量。选择不同菌落使用三线法纯化细菌后,选用单个菌落使用VITEK MS全自动微生物质谱检测系统鉴定细菌种类,校准菌株为大肠埃希菌ATCC 8739,上述实验步骤均为无菌操作。

3.3药敏实验 HC组实验猪检出及鉴别后的菌种,取纯化后的单个细菌菌落,使用无菌生理盐水制备浓度为0.5麦氏的细菌悬浊液,将细菌悬浊液取0.1 mL接种于MH琼脂平板上,待平板风干后,取抗生素药敏试纸以及空白药敏试纸轻贴于MH平板上,将MH平板倒置于37 ℃恒温箱培养24 h后取出测量药敏环直径。药敏结果根据美国临床实验室标准化研究所(clinical and laboratory standards institute,CLSI)2022年制定的药敏实验指南M100-S32进行判读,使用大肠埃希菌ATCC 25922进行药敏质控,结果以敏感(sensitivity,S)和耐药(resistance,R)表示。同一只实验猪弹道入口和弹道出口检出的同一种细菌分别做药敏。

4 统计学分析

结 果

1 一般情况

HC组与LN组所有实验猪在死亡时间点或24 h解剖时均观察到有肠管贯通伤。两组实验猪在伤后出现不同程度的战栗,毛发竖立。HC组实验猪伤后立即出现弹道周围皮肤红肿发热,红肿范围随时间延长而增大,入口伤道有少量淡红色血样液体渗出,伤道直径随时间逐渐缩小,24 h时存活的7只实验猪中有5只出现伤口闭合结痂;出口有淡棕色液体流出,4～8 h间开始观察到脓液分泌并出现恶臭,伤口观察至24 h未见闭合。LN组实验猪也出现上述表现但其24 h存活的9只实验猪中有3只出现弹孔入口闭合结痂的情况;2～4 h间出口开始出现分泌脓液和闻及恶臭,截止到24 h也未见闭合。

2 体温变化

HC组出舱时体温显著高于LN组(P<0.001),在观察的24 h内HC组实验猪体温一直处于高位,HC组实验猪体温在8 h后缓慢降低,在2、4、8 h时间点HC组体温均显著高于LN组(P<0.001)。LN组伤后体温随时间逐渐升高,在伤后2 h内和8～12 h阶段体温升高最为明显,对比前一时间点差异有统计学意义(P<0.01),LN组24 h体温超过HC组但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1及表1。

表1 不同组别不同时间实验猪伤后体温变化重复测量方差分析结果

图1 不同组别不同时间实验猪伤后体温变化情况。与同组前一时间点相比,##P<0.01,###P<0.001;与相同时间LN组相比,*P<0.05,***P<0.001

3 弹道细菌增殖情况

两组实验猪在伤后无论是弹道入口还是弹道出口组织细菌均随时间大量增殖。除HC组弹道出口12 h与24 h之间的差异无统计学意义(P>0.05)外,其余弹道入口和弹道出口对比前一时间点差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01或P<0.001)。两组各自组内的弹道出口对比弹道入口,所有时间点几乎均相差2～3个数量级且差异显著(P<0.01或P<0.001)。LN组除24 h弹道入口与HC组差异无统计学意义(P>0.05)外;其余无论是弹道入口还是出口,在相同时间点LN组的细菌计数均显著高于HC组(P<0.001)。见表2。

表2 HC与LN组实验猪伤后不同时间点弹道组织细菌计数组:n=9;HC组:n=7)

4 弹道细菌分类占比

LN组伤后早期弹道入口检出的细菌大多是肠道细菌混合着表皮细菌,肠道细菌以大肠埃希菌为主,表皮细菌以各类葡萄球菌为主,随时间发展入口检出的细菌逐渐被肠道细菌替代,到12 h后无表皮细菌检出;出口早期以大肠埃希菌和屎肠球菌等肠道细菌为主,仅有少量表皮细菌被检出,4 h后无表皮细菌检出。HC组伤后早期弹道入口检出的细菌也为肠道细菌混合着表皮细菌,但以大肠埃希菌、屎肠球菌和粪肠球菌为主的肠道细菌多见,后期入口检出的细菌逐渐被肠道细菌替代,24 h无表皮细菌检出;其出口早期和入口相同,以大肠埃希菌和屎肠球菌等肠道细菌检出为主,仅有少量表皮细菌被检出,8 h后无表皮细菌检出。见表3。

表3 HC组与LN组实验猪伤后不同时间点弹道组织细菌检出情况(检出/标本数,标本数为该时间点存活实验猪数量)

5 高原寒冷环境弹道细菌药敏结果

HC组实验猪共检出不同种类细菌14种,各类抗生素耐药率在50%以上的细菌种类为氨苄西林7种,青霉素9种,亚胺培南1种,四环素11种,头孢他啶2种,氧氟沙星6种,阿奇霉素9种,庆大霉素3种。检出数量最多的5类细菌中,大肠埃希菌除了对亚胺培南和阿奇霉素敏感外,对其余的6种抗生素均有较高的耐药性;屎肠球菌仅对阿奇霉素的耐药性稍低,但对包括亚胺培南在内的其余7种抗生素均有很高的耐药性;粪肠球菌对氨苄西林及亚胺培南敏感,对余下6种均耐药;不解乳糖链球菌对氨苄西林、青霉素、亚胺培南及头孢他啶敏感,余下耐药性均较高;金黄色葡萄球菌对亚胺培南、阿奇霉素及庆大霉素较敏感,对余下抗生素耐药性较高。见表4。

表4 HC组检出细菌不同抗生素药敏敏感与耐药情况(%)

讨 论

肠道在腹腔中分布范围广,在腹部火器伤中损伤的概率最高,可达50%左右[9]。肠道是人体最大的微生物库[10],损伤时其内容物流出后不仅会导致严重的腹膜刺激症状,而且细菌将在腹腔内大量繁殖,形成化脓性腹膜炎,导致脓毒血症、感染性休克、多器官功能衰竭而死亡,这也是腹部火器伤后期死亡的主要原因[11]。即使经过紧急处理以及后续手术治疗,手术部位感染的概率仍很高,其中肠液流入弹道深部组织是感染不易控制的重要原因之一[12]。高原地区由于低温、低氧及干燥的特点使得该环境中菌落数及细菌毒力均低于平原地区,这可能是造成高原地区腹部以外部位火器伤后伤道细菌含量低,伤道感染表现轻以及出现时间晚的主要原因[13]。殷作明等[14]发现高原可降低实验猪后腿弹道细菌繁殖速度、毒力及感染时间,而且感染均由外界细菌进入无菌内部繁殖造成。但高原腹部肠管火器贯通伤,子弹会贯穿肠道组织,尤其是子弹穿透结肠时会使得大量肠道内细菌进入弹道,同时肠内容物溢出后也会逐渐蔓延到弹道组织内。肠道为人体最大的细菌库,其含有的细菌不仅致病力强,且数量大,使得腹部弹道组织感染加速,而且细菌含量也比其他部位的弹道多。本实验中HC组腹部火器伤后,弹道入口组织内的细菌随时间的延长进行大量繁殖,12 h即到达了感染的标准,和LN组弹道入口8 h达到感染标准以及刘江伟等[15]得出的平原地区8 h为腹部弹道感染时限相比延迟了约4 h;但和殷作明等[14]所建立的高原后腿部软组织火器伤后24～48 h细菌才繁殖到105cfu/g相比还是大有提前。HC组弹道出口从2 h起,组织细菌含量就达到了105cfu/g,高于弹道入口,但还是远低于LN组弹道出口2 h的细菌含量。HC组弹道入口细菌含量一方面提示了相比于平原地区,高原暴露降低了弹道细菌的繁殖速度,延长达到感染的时间;但由于肠道细菌进入弹道,导致细菌含量、繁殖速度均快于其他部位的高原火器伤,与其他部位的高原火器伤可以延迟清创相比,高原腹部火器伤应尽快清创及应用抗生素救治。另一方面弹道出入口细菌含量并不一致,弹道出口细菌含量更多及繁殖速度更快,提示了清创时间应该以弹道出口的感染时限为主要参考,除了肠道破裂后肠液流入弹道外,子弹引起的组织空腔效应对含菌肠液的吮吸作用可能是弹道出入口细菌含量不一致以及弹道出口一开始细菌就大量存在的原因[16]。

腹部枪弹伤后感染加重以及疼痛应激导致体温会随着时间不断升高[17]。LN组伤后体温不断升高,在8～12 h内大幅升高,这可能与其腹腔感染加重有关。高原环境中,无论是实验老鼠还是人员都观察到核心体温下降,有研究表明高原寒冷环境下基础代谢抑制以及体温调定点下降,使得机体进入高原环境短时间内体温会降低,而后体温调定点适应性上移,体温将稍回升但仍低于正常体温[18],同时在人体中可观察到在高原环境中皮肤温度升高,这可能与高原环境中脏器中的血液因低氧进行全身重新分布有关[19]。有研究者观察到猪的核心体温在10～25 ℃的环境中较常温环境无明显变化,但本实验中HC组实验猪的体温伤前及伤后一直都偏高,随时间几乎没有变化,而且在2～12 h时间点均高于LN组。而LN组实验猪在上述时间点里,无论是弹道细菌检出,还是一般情况观察均提示LN组比HC组感染时间更早,感染程度更重,所以对于早期HC组实验猪体温高于LN组,可能是高原的应激反应使得HC组实验猪体温升高。后期脱离高原环境后,HC组体温仍处于高位,可能感染在其中起着主导因素。但其机制仍有待进一步研究。虽然高原寒冷环境创伤后低体温多见,但医护人员对患者低体温的认识不足以及重视程度不高,这也提示在高原环境发生战创伤时,体温变化需要高度重视,高温或低体温都有可能出现,需要及时对症处理。

高原独特的地理环境不仅会降低细菌的繁殖速度,而且会减少环境中的细菌种类,以及改变肠道菌群的构成[20]。本研究实验中共检出不同种类细菌20种,其中革兰氏阳性菌(G+)15种,革兰氏阴性菌(G-)5种。HC组与LN组均检出的细菌有不解乳糖链球菌、产气肠杆菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、解没食子酸链球菌、金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、屎肠球菌、猪表皮葡萄球菌、猪链球菌和猪葡萄球菌共11种,仅在HC组被检测出的细菌有非脱羧勒克菌、科氏葡萄球菌、类少动鞘氨醇单胞菌共3种,仅在LN组中检测出的有产气巴斯德菌、产色葡萄球菌、解淀粉酶芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、猪肠链球菌和无害李斯特菌共6种。HC组弹道入口检测出的细菌是以大肠埃希菌和屎肠球菌为代表的肠道细菌为主,其次才是金葡菌等表皮细菌,出口仅有少量的猪表皮葡萄球菌被检出,其余全是肠道细菌,而且对比LN组所检测出的细菌种类偏少,这也反映了高原低压、低氧、寒冷环境对某些皮肤定植菌具有抑制作用,对肠道菌群构成有一定的影响。两个实验组无论是弹道出口还是弹道入口,随着时间的发展,弹道检出的细菌最后仅剩下了肠道细菌,而且其8 h后细菌的增殖速度减缓,这可能与细菌之间的资源竞争性抑制有关[21-22]。

肠道细菌和表皮细菌是耐药的高发菌种[23-24],而且有研究表明高原寒冷环境会改变细菌的药敏情况[6]。对于平原低海拔地区的腹部火器伤和伤及肠管的贯通伤,关于肠道细菌、外界皮肤和环境细菌以及特殊细菌感染用药的相关研究,国内外已有相关报道以及相对应的救治策略[25-26]。因此本实验仅针对HC组实验猪弹道检出细菌做药敏实验。本研究选用不同作用机制的8种最常用的抗生素对从HC组检测出的细菌进行药敏实验。耐药性最严重的是屎肠球菌,其对阿奇霉素耐药性低,但敏感性也不高,对包括亚胺培南在内的其余抗生素均耐药;其余的细菌也是对1种或者多种抗生素耐药。HC组检测出的14种细菌中,对青霉素、四环素、阿奇霉素、氨苄西林耐药率在50%以上的细菌分别有9、11、9、7种,可见高原环境暴露后细菌耐药性仍很严重。耐药率50%以上就不建议经验性用药,而需根据药敏结果选用抗生素[27],但在高原特殊环境下,并不具备该条件,而且感染时间早而且速度快,所以无论在损伤发生的任何时间点,均需及时联合足量使用抗生素,并需包含如亚胺培南等高级抗生素以控制感染。

综上所述,本研究通过培养、分离及鉴定高原寒冷复合环境猪腹部肠管火器贯通伤后不同时间点弹道细菌,以及对分离的细菌进行药敏实验,结果提示高原寒冷环境会降低腹部火器伤弹道细菌的繁殖速度,减少弹道内部表皮细菌含量及种类,以及改变肠道菌群结构;但腹部肠管火器贯通伤后弹道的细菌含量高且繁殖速度快,导致其达到感染时间早,提示伤后仍需尽早清创,及时足量联合使用抗生素,以期控制感染,提高救治效果。

作者贡献声明：屈金权:实验设计及操作、数据收集分析、论文撰写;李佳佳:实验设计与指导、数据分析;杨欣悦、孙赳、梁飞行、宋来阳:实验操作、文献检索、资料收集整理;靳向辉:实验研究指导及操作;刘江伟:课题及实验设计、指导,论文修改及审校