CD27在食管癌中的表达及其潜在基因通路的综合分析

肖凡凱,王琳,杨帆

(郑州大学第一附属医院:1肿瘤科,2互联网医疗系统与应用国家工程实验室,3心血管内科,郑州 450052)

食管癌是全球第八最常见的癌症,在肿瘤引发死亡率中居世界第六位[1]。食管鳞状细胞癌是食管癌最常见的组织学类型,约占所有食管癌的90%[2]。中国食管癌发病率高,且人口众多,世界范围内约有一半的新增食管癌病例发生在我国[3]。尽管治疗方法在不断更新,但食管癌患者5年生存较差,分子机制病因尚不清楚,从以往的流行病学研究来看,基因对食管癌的发展有重要影响。为了提高食管癌患者的总生存率,验证预后因素和评估新的诊断生物标志物是非常必要的。近年来,单克隆抗体特别是免疫调节剂在各种癌症治疗和生存分析中发挥了潜在的作用。CD27是记忆B细胞的标志物,是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族之一[4]。CD27和CD70之间的相互作用,可以共同刺激T细胞的生长和分化。根据最近学术研究,骨髓瘤细胞中CD27的异常表达可能与肿瘤的生存阶段有关[5]。与此类似,急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)和慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)患者也表现出CD27的组成性表达[6,7]。然而,CD27在实体瘤的研究报道较少,关于食管癌患者CD27表达水平的研究更是十分有限。因此,本研究旨在探讨CD27在食管癌中表达及其潜在的基因调控网络,研究CD27作为预后生物标志物和治疗靶点的相关性,为食管癌的诊断和治疗提供新的生物标志物及诊断依据。

1 材料与方法

1.1 CD27的mRNA表达分析

基于基因表达水平值的交互式分析平台(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)使用来自基因型组织表达和癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)项目的RNA测序数据进行各种肿瘤类型的预后分析、单基因分析、多基因分析和可视化分析。GEPIA根据用户定义的样本选择和方法动态绘制给定基因的表达谱。结果可以以点图(在“profile”选项卡中)或框图(在“Boxplot”选项卡中)的形式呈现。此外,GEPIA在TCGA临床注释的基础上按病理分期绘制基因表达。利用GEPIA的网络服务进一步分析CD27 mRNA在GEPIA中的表达模式。

1.2 CD27与食管癌相关生存分析

GEPIA基于基因表达水平进行生存分析。该功能允许用户选择他们自定义的癌症类型进行总体或无病生存分析。基于TCGA数据库,利用GEPIA分析CD27在食管癌和头颈部鳞癌预后中的相关性,总生存期为评估指标,做Kaplan-Meier曲线,P<0.05,则认为其具有预后价值。

1.3 CD27通路富集及相关激酶分析

利用cBioportal(https://www.cbioportal.org/)一个开放公共的资源,用于研究、可视化和分析多维肿瘤基因组数据,目前包含225项肿瘤研究。Linkedomics(http://www.linkedomics.org/)是用Linked Omics的Link Finder模块研究TCGA食管癌队列中与CD27相关的表达差异基因,结果采用Pearson相关系数进行统计学分析。所有的结果都在火山图、热图或散点图中以图形形式表现出来。并进行基因本体(细胞组分、通路分析、分子功能)、京都基因与基因组百科全书通路分析。

2 结 果

2.1 CD27表达差异的比较

在GEPIA数据库分析中,为了探讨食管癌中CD27表达情况,本研究分析了CD27在癌与癌旁及不同分期的表达,结果显示CD27在食管癌组织中的表达明显高于邻近正常组织(图1A),CD27在食管癌不同分期表达差异无统计学意义(图1B)。

图1 CD27在食管癌与癌旁组织表达情况及在食管癌不同分期的表达情况Figure 1 Expression of CD27 cancer in different stages of esophageal cancer and adjacent tissuesA: cancer and adjacent tissues; B: different stages. ESCA: esophageal carcinoma.

2.2 CD27突变及其相关基因热图

为了研究CD27在食管癌中的突变,本课题通过cBio-Portal依据TCGA数据库食管癌患者的RNA测序情况,发现1915例食管癌患者中有40例(2.1%)患者的CD27发生了突变,其中包含错义突变、扩增和深度缺失,扩增在所有突变中所占比例较大,是最常见的突变类型(图2A)。同时使用Pearson相关性分析列出了食管癌中CD27共表达基因情况,与CD27正相关基因标记为红色,负相关基因标记为绿色,这些基因参与多种信号通路(图2B)。为了进一步明确基因与CD27共表达的正负相关性,依据热图显示前50例与CD27正负相关基因(图3A,B)。3A与3B的基因排名依据的是标准分数(Z-score),分数范围-3～+3。

图2 CD27在食管癌中的突变及相关基因Figure 2 Genetic alteration of CD27 and its related genes in esophageal cancerA: CD27 alteration in esophageal cancer B: CD 27 and its related genes.

图3 CD27在食管癌的Go功能富集分析与相关酶分析Figure 3 CD27 functional enrichment analysis and related enzyme analysis in esophageal cancerA: CD27 pathway enrichment; B: CD27 and its related enzyme.

2.3 CD27在食管癌功能和通路分析

在linkedomics数据库中,对筛选到的CD27的功能进行了评估(图4A,B)。在参与的生物学过程分析中,这些通路主要富集于雷帕霉素复合物(target of rapamycin complex 1,TORC1)信号通路、细胞对亮氨酸的反应和雷帕霉素(target of rapamycin,TOR)信号通路调节(图4A)。通过激酶分析,主要富集途径为KIT原癌基因受体酪氨酸激酶、转化生长因子β受体1和G蛋白偶联受体激酶3(图4B)。

图4 CD27在食管癌的相关性基因热图Figure 4 Hallmark gene set activity changes across the TCGA esophageal cancer patients with low or high expressionA: heat maps showing genes positively related with CD27 in esophageal cancer; B: CD27 and its negative correlated genes in esophageal caner. TCGA: the cancer genome atlas.

2.4 CD27与食管鳞癌及头颈部鳞癌生存分析

为了进一步研究TCGA数据库中CD27与食管鳞癌与头颈部鳞癌生存关系,本课题通过GEPIA中TCGA数据做出CD27在食管癌中与头颈部鳞癌的预后分析。结果显示,虽然食管癌组CD27对总生存没有显著影响,但高表达组的总生存较好(图5A),头颈部鳞癌组中CD27低表达与总生存时间缩短显著相关(P<0.05;图5B)。

图5 CD27表达高低与食管癌及头颈部鳞癌的生存关系Figure 5 Relationship between CD27 expression and 2 types of cancer survivalA: CD27 and esophageal cancer; B: CD27 and head ,neck squamous cell carcinoma.

3 讨 论

食管癌是最常见的癌症之一,在世界范围内的5年生存率很低。免疫疗法是一种增强或再生免疫系统以发现并摧毁肿瘤细胞的治疗方法。最近,对可能用于癌症免疫治疗的生物标志物的研究有所增加[8]。根据早期的研究,CD27可能会成为癌症免疫治疗中最可选的新靶点之一[9,10]。基于TCGA数据库,本研究发现,CD27在食管癌中突变率为2.1%(40/1915),在食管癌和邻近正常组织mRNA表达评估中,CD27在食管癌组织中显著高表达。本研究的相关热图基因与CD27相互作用可能与不同肿瘤相关,例如有研究显示,LAX1与CD27被列入与乳腺癌HER2阳性预后相关基因[11]。TOR复合物在CD27及其相关基因通路富集中具有重要功能。近年来,TOR信号通路的靶点已发展到将营养感知与细胞发育联系起来,并且在真核生物中高度保守。在细胞中,TOR存在于TORC1和TORC2中,这是两种不同的信号复合物[12]。这些复合物受到多种调控,并作为多种细胞功能的信号效应器,包括蛋白质合成、细胞骨架重组、自噬、代谢和存活。哺乳动物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)在胚胎发育中起着关键作用,并与成年物种的衰老和长寿效应有关。mTOR通路参与了人类几种不同癌症类型的发展,其失调与家族性癌症综合征有关[13,14]。

在人类中,CD27仅在淋巴系中通过T、B和NK细胞及其直接前体表达。重要的是,CD27已经存在于初始CD4+和CD8+T细胞中,大多数其他共刺激肿瘤坏死因子仅在T细胞激活后合成。激活后,初始CD4+和CD8+T细胞会短暂上调CD27的表达[15]。活化的T细胞以蛋白水解的方式从细胞表面脱落CD27,从而产生循环可溶性CD27,可作为T细胞活化的诊断标记物[16]。终末分化效应CD8+T细胞丢失CD27,而长寿的中枢记忆细胞保留CD27。在小鼠模型中,已经通过多种研究评估了CD27激动剂促进癌症免疫的功效。在B细胞或树突状细胞上转基因表达CD27的小鼠中,针对携带外源抗原的EL-4淋巴瘤[17]和B16黑色素瘤[18],以及亲代肿瘤的抗肿瘤免疫功能均得到提高[19]。用小鼠CD27的激动性单抗治疗小鼠,同样提高了对T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤以及黑色素瘤的抗肿瘤免疫[20]。近年来,许多学者对CD70-CD27信号轴产生了兴趣,早期报道发现,尽管在正常浆细胞中可以看到CD27的表达,但随着多发性骨髓瘤的进展,CD27的表达会急剧下降,但CD27和CD70转染物共培养并不会通过CD27-CD70信号轴诱导细胞凋亡[21]。一项研究显示,在TCGA数据库中,CD27表达下调与头颈部鳞癌预后不良相关[22]。通过TCGA数据库检测CD27与食管癌患者总生存率的关系,结果显示,虽然差异不显著,但CD27低表达的患者预后比CD27高表达的患者差,与先前报道相似[22],CD27低表达与头颈部鳞癌总生存期降低显著相关。

本研究结果表明,不同水平的CD27在食管癌中的表达对TOR复合物、多种激酶(KIT原癌基因受体酪氨酸激酶、转化生长因子受体1和G蛋白偶联受体激酶3)以及细胞膜有一定影响,未来应注重研究CD27在食管癌表达中对原癌基因受体的影响,并探讨潜在机制。本研究局限性如下:TCGA有关食管癌总生存和CD27测序的样本量较小,需要在人群中扩大样本量,减小误差,以确认这些生物标志物的可行性。

综上,本研究通过生物信息学分析,发现CD27在食管癌中差异表达与通路和激酶密切相关,发现CD27可能被认为是一种新的潜在生物标志物,未来有望投入食管癌靶向治疗的临床应用。