老年鼻咽癌癌组织中Kruppel样因子5及Kruppel样因子9表达与患者复发的相关性

徐敏,周金,范冶,徐飞

(湖南省脑科医院:1病理科,2检验科,长沙 410007)

鼻咽癌即发生于鼻咽腔顶部及侧壁的恶性肿瘤,具有较高的发生率[1]。目前放疗是治疗鼻咽癌的首选方式,伴随着医疗技术的进步,患者的临床症状及预后均有较好的改善,但治疗后仍具有较高的复发风险[2,3]。Kruppel样因子5(Kruppel-like factor 5,KLF5)、Kruppel样因子9(Kruppel-like factor 9,KLF9)属于Kruppel样因子家族成员,属于锌指型转录因子的一种,可参与至多种生物学过程中,如细胞的增殖、分化、转移以及胚胎发育等过程中,目前已证实KLF5、KLF9在食管癌[4]、子宫内膜癌[5]、肺癌[6]等恶性肿瘤中均有表达。同时亦有证据指出喉癌患者癌组织中KLF5表达与喉癌的病情、复发等关系密切[7]。然而关于癌组织中KLF5、KLF9表达与老年鼻咽癌患者复发间的关系尚不清晰。本研究对老年鼻咽癌患者癌组织中KLF5、KLF9进行检测,并分析KLF5、KLF9与患者治疗后复发间的关系,期望为此类患者的治疗及预后改善提供帮助。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2016年5月至2018年5月湖南省脑科医院收治的263例老年鼻咽癌患者的临床资料。纳入标准:(1)经病理检查证实为鼻咽癌;(2)年龄≥60岁;(3)各项临床资料信息完善。排除标准:(1)既往有治疗史,如放疗、化疗、靶向治疗等;(2)存在远处转移;(3)治疗前经评估存活时间不足3个月;(4)近期有重大外科手术治疗史或未得到控制的全身感染;(5)合并血液系统疾病或自身免疫性疾病;(6)入院时存在严重的心、肝、肾功能异常。

1.2 方法

1.2.1 信息收集 所有患者均在入院3d内及治疗结束后收集基础资料信息,包括性别、年龄、国际抗癌联盟(union for international cancer control,UICC)分期、病理类型、疗程延长时间、放疗剂量、是否放疗联合化疗、是否鼻腔受侵、是否口咽受侵、是否颅底骨质受侵、是否颅内受损、是否颅神经损伤。

1.2.2 治疗方法 患者入院后均接受放射治疗,完成定位后常规行外照射,剂量63～88Gy,颈部预防照射剂量50～54Gy。其中T3～4、N2～3、M0期患者接受4个周期的化疗治疗,顺铂(生产单位:山东罗欣药业集团股份有限公司,国准药字:H20046375,规格:10mg)75mg/m2,静脉滴入,1次/d,5-氟尿嘧啶(生产单位:西安海欣制药有限公司,国准药字:H20050511,规格:0.25g)500mg/m2,静脉滴入,1次/d。

1.2.3 Western blotting 待检瘤体经匀浆机处理后离心,弃上清,加人含有1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的放射免疫共沉淀试剂(radio immunoprecipitation assay, RIPA;上海碧云天生物技术有限公司)1000μl,二辛可宁酸(bicinchoninic acid,BCA)法检测蛋白含量。蛋白变性后每孔上样30μg,经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分离蛋白质,随后在300mA的恒定电流下将蛋白电转移到聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride, PVDF)膜(Millipore, Bedford, MA, USA)上。用5%脱脂奶粉将膜封闭1h后,加入一抗KLF5(1∶1000, ab137676,Abcam,MA,USA),抗KLF9(1∶1000,ab313447,Abcam,MA,USA),抗β-actin(1∶1000,ab6276,Abcam,MA,USA)于4℃孵育过夜,常规洗涤,加二抗室温孵育60min,再用含Tween的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(tris-buffered saline with Tween, TBST)洗膜4次,每次8min。采用Thermo公司的增强型底物化学发光(enhancedchemiluminescence, ECL) Western blotting Substrate试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)进行X光显影。

1.2.4 院外随访 所有患者治疗结束后均行5年院外随访,均通过电话或门诊复查的方式随访,若电话无法接通则1周后再次随访。第1年每3个月随访1次,后续每6个月随访1次,

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组老年鼻咽癌患者基础资料信息比较

263例老年鼻咽癌患者治疗结束后行5年院外随访,复发患者共27例(10.27%)。与非复发组患者相比,复发组患者UICC分期Ⅲ～Ⅳ期、未行放疗联合化疗、颅底骨质受侵、颅神经损伤占比较高,差异有统计学意义(均P<0.05);其他指标比较,差异无统计学意义(表1)。

表1 两组老年鼻咽癌患者基础资料信息比较Table 1 Comparison of basic data of elderly patients with nasopharyngeal carcinoma between two groups

2.2 两组老年鼻咽癌患者KLF5、KLF9相对蛋白表达量比较

表2 量化赋值表Table 2 Quantization assignment table

与非复发组患者相比,复发组患者KLF5、KLF9相对蛋白表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05;图1)。

图1 Western blotting检测老年鼻咽患者KLF5、KLF9表达Figure 1 Western blotting image of KLF5 and KLF9 expression in elderly nasopharyngeal carcinoma tissues KLF5: Kruppel-like factor 5; KLF9: Kruppel-like factor 9.

2.3 KLF5、KLF9对老年鼻咽癌患者复发的预测价值

对KLF5、KLF9进行ROC曲线分析,其对老年鼻咽癌患者复发有较好的预测价值,且联合预测价值更高,曲线下面积分别为0.800、0.790、0.894,灵敏度分别为0.704、0.704、0.815,特异度为0.949、0.881、0.962,其中KLF5、KLF9的最佳截断点分别为2.495、0.305,且均P<0.05(图2)。

图2 KLF5、KLF9预测老年鼻咽癌患者复发的ROC曲线Figure 2 ROC curve of KLF5 and KLF9 in predicting recurrence of elderly patients with nasopharyngeal carcinoma ROC: receiver operating characteristic; KLF5: Kruppel-like factor 5; KLF9: Kruppel-like factor 9; AUC: area under the curve.

2.4 多因素logistic回归分析老年鼻咽癌患者复发的危险因素

以P<0.05的变量为自变量,以是否发生复发为因变量(表2),进行多变量logistic回归分析,结果显示UICC分期Ⅲ～Ⅳ期、未行放疗联合化疗、颅底骨质受侵、颅神经损伤、KLF5<2.495、KLF9<0.305是老年鼻咽癌患者复发的危险因素(P<0.05;表3)。

表3 多因素logistic回归分析老年鼻咽癌患者复发的危险因素Table 3 Multivariate logistic regression analysis of risk factors for recurrence in elderly patients with nasopharyngeal carcinoma

3 讨 论

鼻咽癌的致病因素较多,包括遗传、病毒感染、环境等,近年来随着人们生活方式的改善及致病因素的增多,此类患病群体呈现出明显增加的趋势,故如何积极有效地治疗该疾病受到众多临床医师及患者的关注[8]。鼻咽癌对于放射治疗具有较高的灵敏性,可较好的改善患者预后,然而患者治疗后复发仍是临床亟需解决的难题。

本研究结果显示,263例老年鼻咽癌患者5年复发率为10.27%,与既往吴晓峰等[9]报道的10.61%相接近。本研究结果显示UICC分期Ⅲ～Ⅳ期、未行放疗联合化疗、颅底骨质受侵、颅神经损伤为患者治疗后复发的危险因素。同时吴晓峰等[9]、林灿峰等[10]在研究中亦指出未行化疗、颅底受侵、颅神经损伤为鼻咽癌治疗后复发的危险因素,可与本研究结果佐证。

Kruppel样因子是一种可参与至细胞增殖、分化中的高度保守锌指蛋白家族,KLF5、KLF9均广泛存在于人体各组织中,可通过调节相关靶基因对细胞的增殖与凋亡发挥作用,其中KLF5具有致癌与抑癌的双重作用,可对下游的靶基因细胞周期蛋白D1、整合素亚单位α3等进行调节,周期蛋白D1高表达时可造成细胞增殖失控、恶性成长,进而形成恶性肿瘤[11]。孟聪聪等[12]在研究中指出KLF5的高表达与甲状腺乳头癌患者出现淋巴结转移和腺外侵犯的发生关联密切,可能会促使甲状腺乳头癌患者肿瘤细胞的侵袭和转移,从而导致淋巴结转移和腺外侵犯等恶性表型的形成。同时孙振层等[13]也指出KLF5高表达可导致前列腺癌患者的存活期缩短,影响预后。但赵影颖等[7]亦指出KLF5低表达与喉癌患者的复发及病情进展有关。由此可见不同恶性肿瘤中KLF5呈现出不同表达,本研究中复发患者KLF5呈低表达,可能是KLF5低表达后调控了周期蛋白D1的上调。KLF9则能与基质金属蛋白酶28的启动子区域产生特异性结合,通过调节基质金属蛋白酶28的表达可达到抑制肿瘤细胞的作用,同时KLF9通过对氧化应激进行调节可促使肿瘤细胞凋亡,KLF9表达降低则可能导致其对肿瘤细胞的抑制作用减弱[14,15]。最后为明确老年鼻咽癌患者复发的影响因素,本研究开展多因素logistic回归分析,证实UICC分期Ⅲ～Ⅳ期、未行放疗联合化疗、颅底骨质受侵、颅神经损伤、KLF5、KLF9是老年鼻咽癌患者复发的危险因素,同时ROC分析证实KLF5<2.495、KLF9<0.305时可用于老年鼻咽癌患者治疗后复发的预测,且两者联合预测价值更高。因此后续在老年鼻咽癌的治疗中或可对上述因素予以积极的关注,或可为疾病的治疗提供新的思路、为预后的改善提供积极帮助。

综上,老年鼻咽癌患者复发受到诸多因素的影响,其中KLF5、KLF9与患者治疗后复发关系密切,患者治疗过程中积极检测KLF5、KLF9表达或可为疾病的治疗及预后改善提供帮助。