红曲霉奶酪的成熟条件工艺优化及品质变化分析

贾向飞,郑远荣,刘振民*,徐杏敏,孙嘉

1(乳业生物技术国家重点实验室,上海乳业生物工程技术研究中心,光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海,200436)2(上海海洋大学 食品学院,上海,201306)

红曲霉奶酪作为具有东方特色的发酵乳制品,外观颜色和风味易于被中国人接受。在分类上,是属于霉菌成熟奶酪。比较知名的霉菌成熟奶酪包括蓝纹奶酪、布里奶酪、卡门贝尔奶酪等,这些奶酪因为具有独特的风味和质地受到众多消费者的青睐。红曲霉具有数千年的食用历史和应用价值[1],将其作为附属发酵剂来开发新型奶酪产品有良好的市场前景。

红曲霉奶酪的品质形成取决于红曲霉的生长以及发酵剂种类、发酵工艺、成熟条件等因素。消费者对奶酪的接受度主要取决于其特定的外观、质地和风味等感官特性。不同类型的奶酪对温度、湿度和成熟时间有不同的要求,尤其对成熟奶酪来说,这些直接影响到产品的品质。高代微等[2]研究了相对湿度和温度对牦牛毛霉霉菌奶酪品质的影响,结果表明,在相对湿度为50%,成熟6 d时,具有最高的感官评分、较好的质构特性以及较高的风味物质含量。陈庭轩等[3]研究了成熟温度对低脂牦牛乳硬质干酪品质的影响,结果表明,成熟温度的提高能增加干酪中游离氨基酸含量,降低硬度和黏聚性,缩短成熟时间并改善品质。虽然已经有研究探讨了特定成熟条件对红曲霉奶酪品质的影响,但关于其条件优化研究还比较缺乏。所以,相比于加工工艺优化[4-5],成熟条件的优化空间还有待提升。

奶酪制作工艺相对复杂,且成熟过程要保证一定的环境条件和防止杂菌污染。奶酪成本的重要组成部分就是时间。目前红曲霉奶酪的成熟方式主要采用变温成熟,即先在25～30 ℃下成熟3～5 d后再12～15 ℃下成熟,最后再放到4 ℃继续成熟或贮藏,成熟时间相对较长均在一个月以上[6-9]。如何在不损坏红曲霉奶酪品质的情况下,尽可能地延长第一阶段的成熟期限,加快奶酪成熟,缩短总体的成熟期,将对奶酪行业发展具有重要意义。

因此,该研究在确定奶酪加工工艺条件和基于实验室前期筛选的2株不产桔霉素且风味良好的红曲霉BC20和红曲霉ZX99的基础上,探究红曲霉添加种类及关键成熟条件,对相对湿度、成熟时间、成熟温度进行单因素试验,以感官得分和pH 4.6可溶性氮(pH 4.6 acidsoluble nitrogen,pH 4.6-SN)含量为指标进行筛选,结合响应面分析进行优化,并进一步对其理化、质构、抗氧化等品质特性进行研究。本研究旨在不降低红曲霉奶酪品质的情况下缩短成熟时间,为未来红曲霉奶酪工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生牛乳、稀奶油,光明乳业股份有限公司;凝乳酶,北京多爱特生物科技有限公司;商业发酵剂FLORA DANICA、STI-13,科汉森有限公司;马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,PDB)培养基、琼脂粉,青岛海博生物科技有限公司;DPPH,美国Sigma公司;总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法),碧云天生物科技有限公司;盐酸、NaOH、硼酸、醋酸盐缓冲溶液,国药集团化学试剂有限公司;沃特曼41号无灰级定量滤纸,美国Cytiva公司;水相聚醚砜针式滤器(0.45 μm、0.22 μm),上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

奶酪槽,Armfiled公司;KT260凯氏定氮仪,丹麦FOSS Scino公司;TA.XTplus型质构分析仪,英国Stable Micro Systems公司;mb45水分测定仪,美国OHAUS公司;Color Flex EZ色差仪;Spectramax M5酶标仪,美国Molecular Devices公司。

1.3 实验方法

1.3.1 红曲霉生长曲线的测定

采用称干重法测量红曲霉的生长曲线,取少量活化好的红曲霉菌丝接入到含50 mL PDB培养基的锥形瓶中,30 ℃、160 r/min摇床培养,每隔24 h取出一个锥形瓶,培养液抽滤后去离子水冲洗3次,100～105 ℃烘干至恒重,称量菌体干重。时间为横坐标,菌丝干重为纵坐标,绘制生长曲线。

1.3.2 红曲霉接种液的制备

从马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基中取少量红曲霉菌丝接种到含120 mL PDB培养基的250 mL锥形瓶中,170 r/min、32 ℃下培养7 d。经装有约1 cm高度脱脂棉的5 mL注射器过滤。稀释平板计数,得到滤液中活菌含量约为106CFU/L。滤液常温保存,现用现制。

1.3.3 红曲霉菌株的选择

将前期实验室筛选得到的不产桔霉素且风味良好的红曲霉BC20和ZX99作为附属发酵剂,按照接种菌种类型共分为3种分组方式,A1:只接种红曲霉BC20;A2:只接种红曲霉ZX99;A3:复合接种红曲霉BC20和ZX99(接种量为1∶1)。成熟完成后测定pH 4.6-SN含量和进行感官评价,选出最佳菌株接种方式。

1.3.4 红曲霉奶酪制作工艺

参照JIAO等[10]奶酪制作方法,略微修改,具体流程如下:

生牛乳→标准化(脂肪∶蛋白质质量比约为1.6∶1)→巴氏杀菌(72 ℃、20 s)→降温(32 ℃)→接种(乳酸菌发酵剂)→发酵(至pH值为6.2～6.4)→添加凝乳酶(0.06 g/kg)→切割搅拌→入模排乳清(不定期翻转,约4 h)→ 盐浸(质量分数20%的NaCl溶液)→晾干后涂抹红曲霉菌液→成熟→真空包装(4 ℃贮藏)

整个制备及成熟期间需严格保持卫生。成熟采用两阶段成熟方式,先在较高温度成熟,然后转入15 ℃继续成熟,直至第25天结束成熟,4 ℃贮藏。

1.3.5 单因素试验设计

选用成熟温度、相对湿度、成熟时间(第一阶段)等3个参数进行单因素试验,通过用蛋白水解指标—pH 4.6-SN含量和感官分析来评价奶酪品质,以此来确定最佳的成熟工艺条件。

1)相对湿度的确定。参照其他霉菌奶酪相关文献[11]及进行预实验,最终设置相对湿度分别为30%、50%、70%、90%。其余参数设置为成熟温度30 ℃,成熟时间7 d。

2)成熟时间的确定。主要根据红曲霉生长曲线中的对数期和稳定期时间以及参照其他红曲霉奶酪相关文献[8, 10]。最终设置为5、7、9、11 d。其余参数设置为成熟温度30 ℃,相对湿度50%。

3)成熟温度的确定。主要参照其他霉菌奶酪相关文献[10]及霉菌的最佳生长温度确定范围。设置为26、28、30、32 ℃。其余参数设置为成熟时间7 d,相对湿度50%。

1.3.6 响应面法优化

在单因素试验的基础上,采用Box Behnken采样原理,相对湿度、成熟温度和成熟时间分别用A、B、C表示,1、0、-1分别代表高中低水平,因素和水平如表1所示,以感官得分作为评价指标。试验一式三份,最后对模型的准确性进行验证。

表1 Box Behnken方案设计因素和水平Table 1 Box Behnken scheme design factors and levels

1.3.7 感官分析

参照徐杏敏等[12]建立的霉菌成熟奶酪感官风味评价体系对奶酪样品进行评价,内容稍作修改,体系由滋味、气味、色泽、质地等4部分组成,采用百分制。具体如表2所示,评价小组由10名专业人员(5男5女)组成。品尝之前用纯净水漱口,随机选择样品进行打分。

表2 红曲霉奶酪感官评价标准Table 2 Standard for sensory evaluation of Monascus cheese

1.3.8 pH 4.6-SN可溶性氮含量测定

参照王童等[13]的方法稍作修改以进行pH 4.6-SN含量测定,称取3 g左右奶酪样品溶于27 mL pH值为4.6的醋酸盐缓冲溶液中,研磨充分后,4 000 r/min离心20 min,之后取5 mL上清液移入消化管中进行凯氏定氮,结果用占奶酪总氮的比例表示。

1.3.9 理化指标测定

pH值测定参照YU等[11]的方法,将奶酪与去离子水按质量比1∶5的比例混合并均质,用pH计测定。采用水分测定仪测定奶酪样品水分含量。色差采用ColorFlex EZ色差仪进行测定;红色素、橙色素和黄色素含量测量参照ZHANG等[14]的方法,分别以70%的奶酪乙醇提取液在505、448、410 nm下的吸光度表示。

1.3.10 红曲霉奶酪质构测定

采用质构分析仪质地剖面分析(texture profile analysis, TPA)二次下压法测定,第1天取样,后每5 d取样1次,将样品切割为3 cm×3 cm×3 cm的方块,在室温下平衡0.5 h进行测试。测量方法设置为2次下压,测前速度1.00 mm/s,测试速度1.00 mm/s,回程速度5.00 mm/s,距离5 mm,探头为P/5,每个数据至少平行测定3次。硬度、黏性、凝聚性、咀嚼性等参数由质构仪直接获取。

1.3.11 抗氧化活性测定

1.3.11.1 奶酪水溶性提取物(water-soluble extractive,WSE)的制备

分别在成熟期第1、5、10、15、20、25天约取添加红曲霉和不添加红曲霉的奶酪各5 g加入适当的去离子水,40 ℃水浴0.5 h,均质机均质3～4 min,匀浆离心(4 ℃,8 000 r/min,20 min),除去上层脂肪,上清液先通过Whatman No.41滤纸之后再通过0.22 μm水相过滤膜过滤,滤液冷冻干燥后-20 ℃冰箱保藏。

1.3.11.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照陈森怡[15]的方法,将0.1 mL、50 mg/mL的奶酪WSE样品和3.9 mL 60 μmol/L的DPPH-甲醇溶液混合均匀,在室温下避光反应45 min,然后测量517 nm处的吸光度A1,对照组用蒸馏水代替样品,结果为A0,以评估DPPH自由基清除能力。结果以清除率表示,其计算如公式(1)所示:

(1)

1.3.11.3 铁还原能力的测定

铁还原能力由碧云天生物(中国,上海)提供的铁还原能力(FRAP法)试剂盒方法进行测定。将不同浓度的FeSO4溶液进行标准曲线制作,样品的铁还原能力以FeSO4溶液的浓度来表示。

1.3.12 数据分析

数据分析采用SPSS 26软件,所有数据进行单因素ANOVA分析,P<0.05表示差异显著,响应面设计采用Design-Expert 13软件,作图采用Origin 2022软件。

2 结果与分析

2.1 红曲霉菌株生长曲线的测定

红曲霉的生长曲线测定如图1所示,有明显的延滞期、对数期、稳定期和衰亡期等4个特征时期。经前期生物学鉴定,红曲霉BC20和ZX99均推测为红色红曲霉[12]。在前5 d,这2株菌生物量相对稳定。第5天后,生物量迅速增大,进入对数期,此时的菌株生长代谢最旺盛。9 d时2株菌到达稳定期,活菌数几乎达到最大水平。11 d后2株菌的生物量逐渐降低,进入衰亡期,这可能与培养体系中营养物质的消耗有关。因此将红曲霉接种液制备选择在5～9 d,其红曲霉奶酪第一阶段成熟时间选择为5～11 d,使其尽可能地提高奶酪成熟效率并保证产品的质量。

图1 红曲霉BC20和ZX99生长曲线Fig.1 Growth curves of Monascus BC20 and ZX99

2.2 红曲霉菌株接种类型对红曲霉奶酪的影响

以不同红曲霉菌株接种类型对成熟后的奶酪进行滋味、气味、质地、色泽等感官指标和蛋白水解指标pH 4.6-SN含量进行评价,其pH 4.6-SN含量代表奶酪蛋白水解的广度,主要是中小肽的含量,来作为表征奶酪成熟度的一个指标[5]。由表3可知,单独添加红曲霉BC20的奶酪质地和色泽好,但滋味和气味差。只加红曲霉ZX99的奶酪风味好,但质地、色泽和pH 4.6-SN含量不佳。这可能是因为红曲霉BC20和ZX99相比,其产酶和产色素能力较强,但风味形成方面不如ZX99,这与其遗传特性密切相关[16]。复合接种这2种红曲霉可综合提高奶酪的感官总分和蛋白水解。因此,最终选择2株红曲霉复配进行后续奶酪研究。

表3 菌株接种类型对红曲霉奶酪品质和蛋白水解指标的影响Table 3 The effect of inoculation types on the quality and proteolytic indexes of Monascus cheese

2.3 单因素试验结果分析

2.3.1 成熟相对湿度对红曲霉奶酪成熟后品质的影响

红曲霉奶酪生产过程中,成熟条件很大程度上影响了奶酪的品质,包括成熟温度、相对湿度、成熟时间、环境清洁度等,这些条件直接影响了发酵剂和红曲霉在奶酪中的生长和代谢,从而对奶酪的理化、风味特征等品质特性产生影响。从表4可看到,随着相对湿度的增加,红曲霉奶酪的pH 4.6-SN含量逐渐增高,表明其成熟度逐渐增大。因为在制作以及后续成熟过程中,来自原料乳中的酶、凝乳酶、发酵剂和红曲霉产生的酶共同作用下使酪蛋白发生水解产生越来越多的中短肽[17]。然而,相对湿度过高会导致奶酪过度水解,质地变软,风味变异,有较强的蘑菇味、霉味及臭味,同时苦味肽含量增加,感官评分降低。这可能是因为相对湿度较高时,红曲霉生长最旺盛,蛋白酶活性较高,同时也有利于发酵剂的生长和繁殖,从而使整体分解蛋白的能力较强,生成更多的可溶性氮和风味物质。相对湿度过低则不利于红曲霉生长和奶酪成熟,导致蛋白水解较差,质地很硬,未形成该有的风味和外观,仅咸味和酸味较为明显,感官评分也很低。因此,选择50%～70%的相对湿度进行下一步研究。

表4 相对湿度对红曲霉奶酪品质和蛋白水解指标的影响Table 4 The effect of relative humidity on the quality and proteolytic indexes of Monascus cheese

2.3.2 成熟时间对红曲霉奶酪成熟后品质的影响

由表5可知,pH 4.6-SN含量随成熟第一阶段的时间增加而增加,这是因为成熟初期微生物尤其是红曲霉在较高温环境条件下,红曲霉生长繁殖快,同时产生大量的蛋白酶,加速了蛋白水解,给予的时间越长,这一特征就越明显。这与XIA等[8]、YU等[11]的研究结果相似。然而,感官评分呈现了一个先增加后降低的趋势,因为在适当范围内,蛋白质、脂肪以及碳水化合物代谢越充分,风味物质产生越多,感官品质越好。如果成熟时间过长,蛋白质过度水解以及风味物质过度积累,导致奶酪的质构和外观评分出现下降,气味和滋味强烈,出现苦味、较强的霉味和形成臭味,致使整体的品质下降。因此,选择合适的成熟时间,一定程度上能加快奶酪成熟,又能使蛋白质和脂肪分解适宜,从而组织状态细腻、风味浓郁但不过度。综合考虑,选择7～11 d进行响应面分析研究。

表5 成熟时间对红曲霉奶酪品质和蛋白水解指标的影响Table 5 The effects of ripening time on quality and proteolytic indexes of Monascus cheese

2.3.3 成熟温度对红曲霉奶酪成熟后品质的影响

由表6可知,随着奶酪第一阶段成熟温度的增加,pH 4.6-SN含量在32 ℃时达到最高点,因为此时红曲霉和发酵剂的整体活力较好,蛋白质分解能力强。感官评分先升后降,这是因为在30 ℃之前,随着第一阶段成熟温度的增加,奶酪的生化反应更加充分,形成了良好的风味和组织状态,从而感官总分升高,这与陈庭轩等[3]研究的结果类似。但32 ℃时,感官评分略有下降,这是由于高温虽能让红曲霉等微生物快速生长,但是过度水解会产生不良风味,破坏组织结构。LECLERCQ-PERLAT等[18]研究发现较高的成熟温度会导致卡门贝尔奶酪产生氨味等不良风味和流动状的外观。SOODAM等[19]研究发现高温对全脂切达奶酪成熟会造成更软、咀嚼性和凝聚力更低的质构特征,影响整体感官品质。综合考虑,选择28～32 ℃用于下一步响应面分析。

表6 成熟温度对红曲霉奶酪品质和蛋白水解指标的影响Table 6 The effects of ripening temperature on quality and proteolytic indexes of Monascus cheese

2.4 响应面结果分析

基于Box-Benhnken采样原理的响应面法优化红曲霉奶酪成熟工艺设计的17组试验结果如表7所示,通过Design-Expert 13软件对表7的数据进行多元回归拟合分析,其红曲霉奶酪感官总分(R)的二次多元回归方程为:

表7 红曲霉奶酪成熟条件工艺优化响应面试验设计及结果Table 7 Design and results of response surface experiment for optimizing the maturation conditions of Monascus cheese

Y=-755.868 75+7.093 75A+47.568 75B+28.531 25C-0.27AB-0.028 75AC-0.268 750BC-0.034 5A2-1.375B2-0.406 25C2

通过此方程得到最佳工艺为:相对湿度为55.3%,成熟时间8.9 d,成熟温度30.2 ℃,验证实验3次,感官得分平均得分为82.2,与预测理论值83.4基本吻合。回归模型的方差分析结果和三维响应曲面图详见电子增强出版附图1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035950)。

2.5 理化指标测定

从图2可知,奶酪的pH值在成熟期间呈先下降后上升趋势,最终pH值为6.27。这是因为前期奶酪中还存在着较多的残留乳糖,发酵剂分解乳糖产生乳酸等酸性物质,从而导致pH值下降[20]。随着成熟的进行,乳糖逐渐耗尽,加上红曲霉的迅速生长,释放蛋白水解酶,使蛋白质分解加快,产生碱性物质如NH+等导致奶酪pH值升高,这可能与红曲霉积累碱性代谢产物较强有关,这与BATTY等[21]和马欢等[22]的研究结果一致。

图2 奶酪成熟过程中pH的变化Fig.2 Changes in pH of cheese during ripening注:小写字母不同,表示差异显著(P<0.05)(下同)。

由图3可知,成熟期间的奶酪水分含量持续下降,且前5 d下降速率较快,这是因为奶酪当天制作成型后,乳清残留和盐渍导致前期奶酪的含水量高且易流失,接种红曲霉后,5 d内未完全覆盖表面。5 d后水分含量下降速率减缓,这是因为红曲霉在奶酪表面形成红色外皮以及在第一阶段成熟结束后采用锡纸包装并放入15 ℃继续成熟,以此减少了水分蒸发作用。此外,红曲霉促进奶酪的生化反应也会产生一些水分,促使红曲霉奶酪的水分不会再出现大幅度下降。最终奶酪水分含量维持在40%左右。这与孙颜君等[23]和袁然等[5]研究结论一致。

图3 奶酪成熟过程中水分含量变化Fig.3 Changes in moisture content of cheese during ripening

色度是评价奶酪外观品质的重要指标,直接影响到消费者对品质的内在判断。由表8可知,L*值随成熟时间延长不断下降,这与脂肪分解有关,脂肪越少,光的散射越低,从而亮度越低[24]。这与王泽等[25]研究一致。奶酪的a*值增加与红曲霉产生的红曲色素含量增加有关。红曲色素是由红曲霉代谢产生的具有活性功能的一类聚酮类化合物,具有抗癌、抗诱变活性、抗氧化等多种生理功能[26]。红、黄和橙3种色素含量逐渐增加,成熟末期趋于稳定,这也是红曲霉奶酪区分于其他霉菌奶酪的显著特征之一。感官评分升高与奶酪在末期形成较好的风味、组织状态和颜色有关。图4展示了红曲霉奶酪成熟前后的外观对比,可观察到成熟后期的奶酪组织状态良好,颜色鲜艳,具有一定的发展潜力。

a-成熟前期;b-成熟后期图4 红曲霉奶酪成熟前后外观对比Fig.4 Comparison of appearance of Monascus cheese before and after ripening

表8 红曲霉奶酪成熟期间其他理化指标测量结果Table 8 Measurement results of other physicochemical indicators during the ripening period of Monascus cheese

2.6 质构测定

由图5可知,奶酪硬度在成熟期间呈现先增加后降低的趋势,主要原因是和奶酪水分含量变化以及成熟度有关。奶酪成熟度的增加促使其酪蛋白结构逐步坍塌,脂肪与酪蛋白熔融在一起,在成熟末期,甚至会出现“流心”状态。咀嚼性表征咀嚼过程中能量消耗,呈现类似趋势,这两者都与奶酪成熟过程中蛋白质持续降解,使其网络结构遭到破坏有一定关系。黏性指的是咀嚼过的食物与口腔黏连的程度,在成熟期间整体呈现出一个下降的趋势,这与蛋白质和脂肪水解程度越来越高有关。凝聚性呈现先减小增加的趋势,这可能与成熟后期蛋白质分子间交联结合能力增加有关,同时也与凝乳酶、凝乳时pH值等多种因素有关[27]。总的来说,这些指标相互影响形成优良的质构特性,保证产品品质[28]。

a-红曲霉奶酪的硬度;b-红曲霉奶酪的黏性;c-红曲霉奶酪的咀嚼性;d-红曲霉奶酪的凝聚性图5 红曲霉奶酪成熟期间的质构变化测定Fig.5 Determination of texture changes of Monascus cheese during maturation

2.7 红曲霉奶酪的抗氧化能力分析

由图6和图7可知,红曲霉奶酪在25 d成熟期内,DPPH自由基清除活性和铁还原能力都逐渐增强,且明显高于对照组奶酪。红曲霉奶酪在成熟结束时其DPPH自由基清除率可达(48.47±1.17)%,对照组奶酪仅为(33.97±0.58)%,增幅可达42.68%。红曲霉奶酪的铁还原能力可达(29.38±1.13) nmol FeSO4/mg Protein,而对照组仅为(18.61±0.61) nmol FeSO4/mg Protein,显著提高57.87%。这可能与成熟过程中蛋白质水解后的一部分小分子肽具有抗氧化活性有关。此外,红曲霉也能够代谢产生一些具有抗氧化活性的化合物,如黄酮类等,有研究表明红曲霉其用于其他发酵食品生产也能提高其产品的抗氧化能力[29-30]。但在20 d后,部分小分子肽继续分解生成氨基酸,导致抗氧化活性略微下降。总体而言,红曲霉可以有效提高奶酪的抗氧化能力。

图6 不同奶酪样品对DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Effect of different cheese samples on DPPH free radical scavenging rate

图7 不同奶酪样品对铁还原能力的影响Fig.7 Effect of different cheese samples on ferric reducing ability of plasma

3 结论

本研究在确定红曲霉奶酪加工工艺和红曲霉菌株的基础上,以感官评价和pH 4.6-SN含量为评价指标,通过单因素试验和响应面对关键成熟条件,对相对湿度、成熟时间、成熟温度进行了优化。结果表明,红曲霉BC20和ZX99复配接种比例为1∶1,相对湿度为55.3%,成熟时间8.9 d,成熟温度30.2 ℃,此工艺下制作的组合菌株红曲霉奶酪组织状态良好、软硬适宜、风味独特、蛋白水解程度高,整体品质优良,更适宜国人口味。品质分析表明,在成熟期间,水分含量下降,pH先下降后上升,成熟完成后水分含量约为40.30%、pH值约为6.27。色度指标中,L*值呈下降趋势,a*和b*呈上升趋势;红曲色素含量也逐渐增加;质构测定中,奶酪的硬度和咀嚼性均先上升后下降,凝聚性先下降后上升,黏性整体呈下降趋势;抗氧化分析表明,红曲霉组奶酪的DPPH自由基清除能力、铁还原能力均明显优于不接红曲霉的对照组奶酪。通过此项研究,一方面可以缩短红曲霉奶酪成熟时间,另一方面证明了红曲霉可以增强奶酪的功能价值,如红曲色素、抗氧化活性等,具有良好的市场发展前景。