多年生黑麦草的防御机制对模拟酸雨和镉复合胁迫的响应

邱 萍，凌显容，郭 巧，胡 霞*

(1.乐山市实验中学，四川乐山 610040；2.乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614000)

酸雨是指pH 值小于5.6 的降水，是因人类活动或自然灾害（森林火灾、火山爆发等）导致降水酸化的一种污染现象[1]。中国酸雨主要分布在四川盆地及长江以南、青藏高原以东的大部分地区。酸雨不仅对植被产生直接影响，还造成水源及土壤酸化，带来严重的生态环境问题[2]。近年来，由于工业活动、城市化进程的快速发展，以及污水灌溉、施用劣质肥料等农业活动，重金属污染问题愈发严重。在所有非植物必需的重金属元素中，镉容易在人体内聚集，最难以修复也最引人关注。据普查，目前全国约有1.3万hm2耕地遭受镉污染，有些地区的农田污染严重超标[3]。重金属进入土壤后被植物吸收，不仅影响植物的生长发育，还会通过食物链积累，最终危害人类健康。酸雨与土壤中重金属有效态含量的多少有一定程度的关系，在酸雨作用下，土壤中重金属在一定程度上被活化，加重了对植物的损害。此外，重金属也会加重酸雨对植物的伤害。在我国，酸雨和镉污染对土壤造成的环境问题非常严重，并且我国酸雨区与重金属污染区有很大程度重叠。目前，国内对酸雨和镉单一胁迫的研究均较多，但对两者的复合胁迫研究相对较少。

多年生黑麦草是禾本科黑麦草属草本植物，在我国长江流域、四川、贵州、湖南、云南等地生长良好，具有生长快、生物量大、根系发达、适应性强、耐酸等优点，并且对铜、镉、铅和锌等多种重金属均有一定的耐性，可在重金属复合污染的土壤上正常生长[4]。因此，本试验以多年生黑麦草为材料，研究其种子萌发及幼苗生长生理对酸雨和镉复合胁迫的响应，为修复酸雨和镉污染的土壤及环境治理提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 模拟酸雨和氯化镉溶液的配制

模拟酸雨的配制：根据四川地区历年的降雨酸度，参照文献配制模拟酸雨[5-7]。按SO42-∶NO3-为8∶1(V/V)，配成pH值1.0的酸雨母液，使用时以蒸馏水稀释，借助pHS-3C 型精密酸度计（上海佑科仪器仪表有限公司）用稀盐酸和稀氢氧化钠溶液调配模拟酸雨的pH值分别为2.5、6.0、7.0。

氯化镉溶液的配制：先配制1 g·L-1的氯化镉母液，然后用蒸馏水分别稀释标定后的母液，配制氯化镉溶液浓度分别为0、0.5、20.0 mg·L-1。

1.2 试验设计

挑选大小一致、种胚完好、籽粒饱满的多年生黑麦草种子（Lolium perenne L.），用1 g·L-1氯化汞溶液浸泡10 min 消毒，然后用大量蒸馏水反复冲洗，沥干水分后将100 粒多年生黑麦草种子均匀摆放在直径为12 mm、垫有3层滤纸的培养皿中（培养皿和滤纸事先经灭菌处理后冷却至室温）。每个培养皿分别倒入不同浓度的模拟酸雨和镉复合胁迫溶液10 mL。复合胁迫处理为：pH 值6.0+Cd 0.5 mg·L-1（处理Ⅰ），pH 值6.0+Cd 40.0 mg·L-1（处理Ⅱ），pH 值3.0+Cd 0.5 mg·L-1（处理Ⅲ），pH 值3.0+Cd 40 mg·L-1（处理Ⅳ），pH 值7.0+Cd 0 mg·L-1（CK）。每个处理重复3次。将培养皿放于20 ℃的恒温光照培养箱内进行常规培养。每2 d添加1次相应浓度的胁迫溶液。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 种子发芽统计

种子发芽统计以突破种皮的胚轴长度达到种子自身的长度为标准，从试验第3 d 开始统计每皿发芽的种子数。试验开始第7 d 计算不同处理下种子发芽率、发芽势和发芽指数[8]。发芽率、发芽势、发芽指数的计算公式如下：

发芽率（GR）=（n/N）×100%（1），式中n 为最终达到的正常发芽粒数，N为供试种子数；

发芽势（GP）=（n3/N）×100%（2），式中n3为种子发芽第3 d的正常发芽粒数，N为供试种子数；

发芽指数（GI）=∑（G7/D7），式中G7为在第7 d的发芽数，D7为相应的发芽天数。

1.3.2 幼苗生长量的测定

试验开始第7 d 每皿随机选择10 粒发芽的多年生黑麦草，测定地上生物量（芽质量）、地下生物量（根质量）和总生物量（芽质量+根质量）。

1.3.3 幼苗生理指标的测定

试验开始第15 d 随机采集不同浓度胁迫的多年生黑麦草幼苗叶片，采用丙酮浸提法用T6新悦可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）进行叶绿素含量的测定；采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量；采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性；采用DDS-307 电导率仪（上海精密科学仪器有限公司）测定相对电导率[9-10]。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2017 进行数据处理及绘图；用SPSS 13.0 进行单因素方差分析（ANOVA），最小显著差异法（LSD）比较组间差异。

2 结果与分析

2.1 模拟酸雨和镉复合胁迫对多年生黑麦草种子萌发的影响

从表1 可以看出，随着镉胁迫的加剧，多年生黑麦草种子发芽势、发芽率和发芽指数均逐渐降低。而随着模拟酸雨胁迫的加剧，种子发芽却没有表现出规律的变化趋势。低浓度的镉和弱酸复合胁迫下（处理Ⅰ）种子发芽势、发芽率及发芽指数均高于对照组，表明此处理不但未对植物造成伤害，反而对多年生黑麦草种子萌发具有一定的促进作用。高浓度的镉和强酸的复合胁迫（处理Ⅳ）下，多年生黑麦草种子的发芽势比对照降低了75.9%，发芽率下降了19.5%，发芽指数下降了45.3%，差异达到显著水平（p＜0.05），种子萌发受到明显抑制。

表1 多年生黑麦草种子萌发对模拟酸雨和镉复合胁迫的响应

2.2 模拟酸雨和镉复合胁迫对多年生黑麦草生物量的影响

从表2 可知，不同浓度的模拟酸雨和镉复合胁迫处理均降低了多年生黑麦草地上生物量、地下生物量和总生物量。同一浓度酸雨胁迫下，随着镉胁迫的加剧，多年生黑麦草生物量逐渐降低。强酸胁迫时（pH=3.0），重度镉胁迫（处理Ⅳ）使多年生黑麦草总生物量比轻度镉胁迫（处理Ⅲ）降低了60.6%。同时，同一浓度镉胁迫下，随着酸胁迫的加剧多年生黑麦草生物量也呈现逐渐降低的趋势，然而差异不显著。统计分析结果显示，模拟酸雨和镉污染的复合胁迫均抑制了多年生黑麦草幼苗的生长，相比于对照，处理Ⅳ复合胁迫使多年生黑麦草地上生物量降低了65.2%，地下生物量降低了73.3%，总生物量降低了67.5%，差异达显著水平（p＜0.05）。

表2 多年生黑麦草生物量对模拟酸雨和镉复合胁迫的响应

2.3 模拟酸雨和镉复合胁迫对多年生黑麦草幼苗叶片叶绿素含量的影响

从表3 可知，低浓度的酸和镉复合胁迫处理（处理Ⅰ）增加了多年生黑麦草幼苗叶片叶绿素含量，促进了叶片叶绿素的合成。在相同H+浓度的酸胁迫下，随Cd浓度升高叶绿素含量降低。然而在相同浓度镉胁迫下，随着酸胁迫的加剧多年生黑麦草幼苗叶片叶绿素含量却并没发生改变。高浓度的酸和镉胁迫下（处理Ⅳ）叶绿素含量最低，为1.1 mg·g-1，显著低于对照（p＜0.05）。

表3 多年生黑麦草叶绿素含量、细胞膜透性和过氧化物酶活性对模拟酸雨和镉复合胁迫的响应

2.4 模拟酸雨和镉复合胁迫对多年生黑麦草细胞膜的影响

从表3 可以看出，不同浓度模拟酸雨和镉复合胁迫下多年生黑麦草幼苗叶片丙二醛（MDA）含量均高于对照组。低浓度镉胁迫时（处理Ⅰ和处理Ⅲ）丙二醛含量仅分别比对照增加了23.5%和6.7%，高浓度镉胁迫（处理Ⅱ和处理Ⅳ）下丙二醛含量则分别比对照增加了29.9%和49.5%。高浓度酸和镉复合胁迫（处理Ⅳ）使黑麦草幼苗丙二醛含量达到最高值，为14.5 mmol·g-1，显著高于对照（p＜0.05）。

和对照相比，两种不同H+浓度的酸胁迫下低浓度镉胁迫（处理Ⅰ和处理Ⅲ）没有改变多年生黑麦草幼苗叶片的相对电导率值（表3）；而高浓度的镉胁迫（处理Ⅱ和处理Ⅳ）均增加了多年生黑麦草叶片相对电导率值，差异达显著水平（p＜0.05）。处理Ⅱ胁迫下幼苗叶片相对电导率达12.9%，处理Ⅳ达13.9%，分别比对照增加了12.6%和21.2%。

2.5 模拟酸雨和镉复合胁迫对多年生黑麦草过氧化物酶活性的影响

与对照相比，低浓度的酸胁迫和镉胁迫（处理Ⅰ）并未显著改变多年生黑麦草幼苗叶片过氧化物酶（POD）活性。同一H+浓度的模拟酸胁迫下，随着镉胁迫的加剧多年生黑麦草POD 活性逐渐降低。弱酸胁迫时（pH=6.0），重度镉胁迫（处理Ⅱ）使多年生黑麦草POD活性比轻度镉胁迫（处理Ⅰ）下降了13.8%；强酸胁迫时（pH=3.0），重度镉胁迫（处理Ⅳ）的POD 活性比轻度镉胁迫（处理Ⅲ）降低了2.7%（表3）。同时，在同一低浓度镉胁迫下，随着酸胁迫的加剧多年生黑麦草POD 活性也呈现降低的趋势。统计分析结果显示，高浓度的镉和不同H+浓度的模拟酸雨复合胁迫（处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）均显著抑制了POD 活性（p＜0.05）。

3 讨论与结论

3.1 讨论

全球普遍存在着两种非生物胁迫：酸雨和重金属胁迫。酸雨和有毒重金属污染土壤时具有隐藏深、作用期长、伤害不可逆等特点，这些特性会导致土壤缺乏营养物质，植株无法从土壤中获取生长发育所需的成分[11]。对于植物而言，早在植株幼苗的生长发育时期，植株就表现出了对外界环境的适应能力，这个阶段是植株适应外界环境的关键期，对植株自身的生长发育具有重要作用[12]。植物种子的萌发和早期生物量的变化情况就可以反映出酸雨和重金属污染对其生长的影响，以往的研究显示，超出植株适应范围的重金属会使植株幼苗的生长发育受到一定程度抑制。本研究中，低浓度的酸雨和镉复合胁迫促进了黑麦草种子的萌发，而高浓度的复合胁迫明显抑制了种子萌发，这与之前的一些研究结果“低促高抑”现象相同。然而，不同浓度酸雨和镉复合胁迫均抑制了多年生黑麦草植株生长，高浓度酸雨和镉胁迫（pH 值3.0+Cd 40 mg·L-1）下黑麦草生物量显著降低，这与代杰等对水芹耐Pb性的研究得出的结论一致，高浓度的重金属胁迫会对水芹的生长发育产生明显的抑制作用[13]。

叶绿素含量的变化对植物的光合作用有很大的影响，既可反映植物叶片光合作用功能的强弱，也可用以表征逆境胁迫下植物组织、器官的衰老状况。叶绿素降低会导致植物光合作用逐渐减弱，从而导致植物在此阶段的生长受阻。本研究中，叶绿素含量与生物量的变化规律相似，即低浓度的复合胁迫促进了叶绿素的合成，而高浓度的复合胁迫显著降低了叶绿素的含量，这与刘英杰等的研究结论类似[14]。有研究认为，不同品种作物叶片中的叶绿素含量随重金属浓度的升高呈现出先升高后下降的趋势。这一研究也表明了酸和重金属对植物叶绿素具有“低促进高抑制”影响[15]。推测造成本研究中这种变化趋势的可能原因是：低浓度的酸和镉处理提高了叶绿素酸酯还原酶的活性和氨基-γ-酮戊酸的含量[16]，使多年生黑麦草幼苗叶片叶绿素含量逐渐增多；而高浓度的酸和镉处理使铁离子无法进入叶绿素，阻碍了合成叶绿素的有效途径[17]。

植物细胞膜是细胞与环境的边界，也是细胞与外界间进行物质运输、能量交换和信息传递的重要场所。当植物遇到逆境时，细胞膜结构受到损伤，膜脂过氧化反应产生的高活性最终产物MDA持续破坏细胞质膜结构，致使电解质渗出引起组织浸泡液的电导率值发生变化。胁迫程度愈大，脂质过氧化程度越大，MDA 含量越高，相对电导率也就越高。本研究发现，高浓度酸和镉复合胁迫显著增加了多年生黑麦草幼苗叶片MDA含量和相对电导率。这与大多数已有的研究结果相似，各种非生物胁迫如干旱、酸雨、重金属等都使植株的MDA含量和相对电导率显著提高[15,18-19]。

通常膜脂过氧化还伴随有活性氧产生，而植物体内的各种氧化酶就组成了一个有效的活性氧消除酶系统。POD 是一类活性较高的氧化还原酶，广泛存在于植物细胞内，与植物的呼吸作用、光合作用等都有关系，尤其作为植物体内消除自由基伤害防护酶系成员之一，与植物的抗逆境能力密切相关。本试验研究结果显示，随着模拟酸雨和镉胁迫的加剧，多年生黑麦草植株体内POD 活性逐渐下降，在高镉胁迫下，下降尤为明显，这与孙天国等在毛尖紫萼藓和杨盛昌等在桐花树上的研究结果相同[20-21]。可能是因为随着胁迫的加剧，多年生黑麦草体内产生了大量的过氧化物，而POD 的消除能力有限，使细胞受到伤害，致使POD活性下降。

3.2 结论

综上所述，低浓度的酸雨和镉复合胁迫促进了多年生黑麦草种子的萌发和幼苗叶绿素的合成，而高浓度的酸雨和镉复合胁迫显著抑制了多年生黑麦草种子的萌发和植株的生长，明显降低了幼苗生物量和叶绿素含量，表现出一定的“低促高抑”现象。为了适应逆境，黑麦草幼苗植株POD 酶活性随着模拟酸雨和镉胁迫的加剧而明显降低，而MDA含量和相对电导率则显著增加。