益生元-乳酸菌发酵活性成分对护肤功效的影响

唐柳映 曹晓蕊 伍文怡 刘可儿 王昌涛

[摘 要]目的 研究益生元-乳酸菌发酵活性成分的抗氧化性能，分析其对护肤功效的影响。方法 采用传统微生物发酵法对表皮葡萄球菌（SE）和植物乳杆菌（PC）进行发酵得到活性成分，之后通过1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）抗氧化检测、羟基自由基清除、超氧阴离子清除等实验方法来检测活性成分的抗氧化能力。结果 两种发酵液的活性成分含量在不同浓度益生元的影响下增长不同，最适宜SE生长的低聚果糖益生元浓度为0.5%，最适宜PC生长的低聚果糖益生元浓度则为1.5%。结论 在2.5%的低聚果糖浓度下培养出的PC羟基自由基清除率效果最佳，对SE更适宜的低聚果糖影响抗氧化性能的浓度为1.5%～2.5%，此浓度下可以得到更高效的益生元-乳酸菌发酵活性成分，从而发挥护肤功效。

[关键词] 益生元；乳酸菌发酵；抗氧化性；化妆品原料

[中图分类号] Q939.11+7 [文献标识码] A [文章编号] 1004-4949（2024）05-0029-04

Effect of Active Ingredients of Prebiotics-lactic Acid Bacteria Fermentation for Skin Care Efficacy

TANG Liu-ying， CAO Xiao-rui， WU Wen-yi， LIU Ke-er， WANG Chang-tao

（College of Chemistry and Materials Engineering， Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China）

[Abstract]Objective To study the antioxidant properties of the active ingredients of prebiotics-lactic acid bacteria fermentation， and analyze its effect on skin care. Methods Staphylococcus epidermoides （SE） and lactobacillus plantarum （PC） were fermented by traditional microbial fermentation method to obtain the active ingredients. Then， antioxidant detection， hydroxyl radical scavenging and superoxide anion scavenging of 1， 1-diphenyl-2-tritrophenylhydrazine （DPPH） were used to detect the antioxidant roperties of the active ingredients. Results The content of active ingredients in the two fermentation solutions increased differently under the influence of different concentrations of prebiotics. The optimal concentration of fructooligosaccharides prebiotics for SE growth was 0.5%， and that for PC growth was 1.5%. Conclusion The hydroxyl radical scavenging effect of PC cultured at 2.5% concentration of fructooligosaccharide is the best， and for SE， the optimal concentration of fructooligosaccharide affecting the antioxidant performance is between 1.5% and 2.5%. At this concentration， more efficient active ingredients of prebioticslactobacillus fermentation for skin care can be obtained.

[Key words] Prebiotics； Lactic acid bacteria fermentation； Antioxidant properties； Cosmetic ingredients

乳酸菌（lactic acid bacteria）是指通過发酵糖类产生乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称[1]。主要通过自身作用、发酵产酸抑制有害菌生长和代谢、产生异生物质3方面发挥其益生作用[2]。而益生菌是一类通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物[3]。乳酸菌作为一种益生菌，具有分布广泛、数量众多、种类丰富的特点[4]。同时，乳酸菌还具有耐酸、耐胆盐、抗氧化、高黏附和生成短链脂肪酸等优良特性[5]。乳酸菌的发酵工艺绿色安全，且趋向于产业化，本研究使用益生元对表皮葡萄球菌（SE）和植物乳杆菌（PC）进行发酵后获得溶胞产物，并对活性成分含量、抗氧化等进行功效检测，旨在探究出益生元-乳酸菌发酵得到的活性成分的最高效的护肤功效浓度或浓度范围，为化妆品微生物天然原料领域增加实验基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 低聚果糖（益生元）、表皮葡萄球菌、植物乳杆菌（乳酸菌）、溶菌肉汤（LB培养基）、MRS肉汤培养基、去离子水、DPPH粉末、无水乙醇、FeSO4粉末、30%H2O2、水杨酸粉末、Tris粉末、盐酸溶液、邻苯三酚粉末。

1.2 实验方法 本实验以低聚果糖作为益生元，分别加入SE和PC的液体培养基。其中，每个菌种各分为6个不同的低聚果糖益生元浓度梯度，即0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%。液体培养基制作完成后加入菌株[6]。取1 ml菌液加入到益生元溶液中，在600 nm的波长下测量OD值。采用DPPH自由基清除能力测定、羟基自由基清除能力测定及超氧根离子清除能力测定这3种方法分别测量6个不同益生元浓度下培养的菌株溶液上清液的自由基清除率，即抗氧化值[7]。

1.2.1菌株的培养 用接种环取适量SE冻存液接种到LB固体培养基中。适量PC冻存液接种到MRS固体培养基中。24 h后，将SE和PC从固体培养基转移至液体培养基，分别溶解于液体培养基（编号0、0号瓶）中。放入摇床培养24 h。SE培养温度为37 ℃，培养湿度为60%；PC培养温度为30 ℃，培养湿度为60%[8]。

1.2.2接菌 从0号瓶每次取1 ml分别加入1～6号瓶中，放入摇床24 h。

1.2.3测定活性成分含量 取6支1.5 ml离心管，均加入去离子水800 μl，再分别加入1～6号瓶溶液200 μl，并做3组重复实验。从每支离心管取100 μl滴入孔板，用酶标仪在波长600 nm下测定OD值。

1.2.4提取上清液 取6支50 ml离心管，分别加入1～6号瓶溶液，每两管一组，在30～50 g两两对称，离心，取上清液。仿照上述步骤提取1～6号瓶的上清液。

1.2.5测定抗氧化性 ①DPPH自由基清除能力测定：首先配制DPPH乙醇溶液，再将样品用样品溶剂进行倍半稀释，并配制成6个梯度，分别稀释100%、80%、60%、40%、20%、10%；其中A1组成分为待测液100 μl、DPPH 100 μl；A2组成分为DPPH 100 μl、去离子水100 μl；A3组成分为待测液100 μl、无水乙醇100 μl；最后避光下反应30 min，在波长517 nm下测吸光度；②羟基自由基清除能力测定：首先配制FeSO4溶液、H2O2溶液、水杨酸乙醇溶液；随后配制待测液：将样品用样品溶剂进行倍半稀释，并配制成5个梯度，分别稀释100%、80%、60%、40%、20%；其中A组成分为蒸馏水0.2 ml、FeSO4溶液0.2 ml、H2O2溶液0.4 ml；B组成分为样品液0.2 ml、FeSO4溶液0.2 ml、H2O2溶液0.4 ml；C组成分为蒸馏水0.2 ml、FeSO4溶液0.2 ml、H2O2溶液0.4 ml；D组成分为样品液0.2 ml、FeSO4溶液0.2 ml、H2O2溶液0.4 ml；将配制好的溶液反应10 min；随后向A组中加入水杨酸乙醇溶液0.2 ml；B组中加入水杨酸乙醇溶液0.2 ml；C组中加入无水乙醇0.2 ml；D组中加入无水乙醇0.2 ml；再次将配制好溶液反应30 min后，对反应液进行2～3 min的离心，各取100 μl上清液加至96孔板中；最后在波长为510 nm下测吸光度；③超氧阴离子自由基清除能力测定：首先配制Tris溶液，随后配制盐酸溶液：盐酸溶液A 0.05 mol/L；盐酸溶液B 10 mmol/L；盐酸溶液C 3 mol/L；再配制Tris-HCl溶液、邻苯三酚溶液；待测液：将样品用样品溶剂进行倍半稀释，并配制成6个梯度，分别稀释100%、80%、60%、40%、20%、10%；其中A1、A2、A3组成分均为Tris-HCl溶液0.5 ml；配制好的溶液均在24 ℃下水浴保温20 min，随后向A1组中加入蒸馏水0.25 ml、邻苯三酚溶液0.2 ml；A2组中加入样品液0.25 ml、邻苯三酚溶液0.2 ml；A3组中加入样品液0.25 ml、蒸馏水0.2 ml，将其混匀，反应17～18 min；向A1、A2、A3组中均加入盐酸溶液C 0.05 ml，反应结束；最后在波长510 nm下测吸光度。

2 结果

2.1 不同益生元浓度下的SE和PC生长情况 0.5%低聚果糖含量的SE发酵液的OD值为0.3949，OD值最大，低聚果糖浓度为1%和浓度为0.5%的SE发酵液的OD值数值相近；1.5%低聚果糖含量的PC发酵液的OD值为0.5789，为其平行对照组中OD值最高，2.5%低聚果糖含量的PC发酵液的OD值为0.5674，与1.5%低聚果糖含量的PC发酵液近似，见图1。

2.2 不同益生元浓度下PC和SE的自由基清除能力在羟基自由基清除率的测量方法下，2.5%的低聚果糖浓度下培养出的PC发酵液的P值（1.4466）高于1.5%的低聚果糖浓度下培养出的PC的P值（0.6444），见图2。同样是在羟基自由基的测量方法下，2.5%的低聚果糖浓度的P值（0.4665）高于1.5%的低聚果糖浓度的P值（0.2891），但二者较为近似，见图3。

3 讨论

乳酸菌具有安全、高效绿色、副产物少、生产成本低等优点，在发酵领域起着十分广泛而重要的作用。国内对于乳酸菌发酵技术逐渐趋于多面化，全世界的乳酸菌市场发展迅猛的同時，我国的乳酸菌市场也在基础研究、成品应用和市场开发等各个方面取得了一定成绩，比如植物基食品乳酸菌发酵开发、乳酸菌生物工程育种等，但大多都是应用于食品方面。近年来，化妆品市场中追求植物或天然原料，追求天然、无添加化妆品功效，乳酸菌是来源广泛的一类天然原料，而乳酸菌发酵得到的活性成分具有很好的抗氧化、抗炎功效，将乳酸菌发酵活性应用于化妆品中，从而增强抗炎、抗氧化等功效，是一种更安全、高效的选择。目前对乳酸菌发酵活性液的功效探究的相关研究甚少，本研究对其展开基础研究，以期为天然化妆品原料领域增加可靠性数据和有力支撑。

本研究结果表明，两种菌在添加益生元低聚果糖的发酵环境中生长状况不同，主要的原因可能是不同种菌代谢低聚果糖的酶系统存在差异[9]。最适宜SE生长的低聚果糖益生元浓度为0.5%，最适宜PC生长的低聚果糖益生元浓度则为1.5%，表明低聚果糖在这两种菌株发酵液中最适添加量，而PC对低聚果糖的适宜浓度较SE高，原因可能是PC对低聚果糖的利用率较高，相宜性好，从而使得菌株生长繁殖快[10]。添加了低聚果糖的菌株发酵液能够有效地清除羟基自由基[11]，且与浓度呈正相关，表明低聚果糖发酵液具有一定的抗氧化活性[12]。发酵液的抗氧化作用对维持微生态的平衡有着重要作用。有研究表明[13]，乳酸菌在发酵时可以增加发酵液中的总酚等化合物的含量，同时增加具有给质子特性化合物的可用性，这些化合物能够有效提高DPPH自由基清除率，从而提高抗氧化活性。从实验结果来看，低聚果糖含量为1.5%与2.5%的SE发酵液和PC发酵液对于羟基自由基的清除率相差无几，经过重复实验、讨论分析认为，可能是添加低聚果糖益生元的浓度差异不大，导致两种发酵液中增加总酚等化合物的含量相差甚微，进而使得抗氧化活性差别不显著[14，15]。

综上所述，添加了低聚果糖的SE和PC发酵液，两种菌均生长旺盛，发酵液的自由基清除能力提高，表明低聚果糖的加入能提高发酵液的抗氧化能力，具体机理有待研究。目前乳酸菌和益生元的种类繁多，使得发酵产物具有差异性，以致发酵液的功能效果不尽相同，因此筛选与乳酸菌最相适宜的益生元还需继续探究。

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收稿日期：2023-11-26 编辑：扶田