流式细胞分析仪检测抗核抗体谱方法学性能验证

徐敏,黎海生,戚南昌,太继琼,蒋金梅（昆明市第一人民医院,云南 昆明 650011）

自身抗体是诊断自身免疫性疾病的重要依据，抗核抗体是细胞内所有核抗原成分的总称，是自身免疫性疾病的重要辅助诊断指标[1]。每种自身免疫性疾病几乎都伴有特征性的自身抗体谱。自身免疫病患者中，有相当一部分病人的血清或其体液中可以检测到一种或多种高效价的自身抗体，能为自身免疫病的诊断、疗效观察等提供非常有价值的依据，自身免疫性疾病的检测方法多种，而在众多的检测方法中，有的操作繁琐，有的对人体有害，而且都不能同时检测多种抗体。根据国内外研究情况介绍，美国ZEUS公司AtheNA检测系统即通过多重微球流式点阵分析（multiplexed bead assay，MBA）技术原理，可同时自动化或半自动化定量检测多种自身抗体，根据CNAS-CL02：2012《医学实验室质量和能力认可准则》的规定[2]，开展使用新方法前，实验室必须对指标的相关性能进行方法学验证评估。本实验室对美国ZEUS公司AtheNA系统Luminex200流式荧光分析仪的主要性能进行验证，确定设备能否达到所要求的性能指标及设备性能是否合格，以确保仪器检测所得结果的准确性和可靠性，这样更有助于临床病情监测与临床用药指导，以及协助自身免疫性疾病的诊断。

1 材料与方法

1.1标本来源 采集昆明市第一人民医院2019年住院病人已检测抗核抗体谱项目的血清及门诊体检正常人血清，避免使用溶血、脂血和细菌污染的标本。

1.2仪器与试剂 美国ZEUS公司AtheNA系统Luminex200流式荧光分析仪，美国ZEUS公司抗核抗体谱检测试剂盒（多重微珠流式免疫荧光发光法）［批号16110003，试剂成分：复合微珠悬浮液、藻红蛋白标记的羊抗-人IgG，实验缓冲液、洗涤缓冲液（10×）］；美国宙斯（Zeus）科技公司生产的AtheNA Multilyte ENA谱（抗核抗体谱）检测试剂盒内标准品。

1.3检测项目 SSA-52、SSA-60、SSB、Sm、RNP、Scl-70、Jo-1、Cent B、ds-DNA（双链DNA）、Nucleosome（抗核小体抗体）、PM-Scl、PCNA、Ribosomal P（抗核糖体P蛋白抗体）、Histone（组蛋白抗体）、M2（抗线粒体抗体）。

1.4实验方法

1.4.1精密度评价 根据CLSI EP5-A2[3]方案来验证其精密度。①批内精密度：收集我院住院患者血清，浓度水平接近医学决定水平样本，样本量为5ml，一天内重复检测20次，计算均数（x）、标准差（SD）及批内变异系数（CV%），批内变异系数（CV%）需符合WS/T 494-2017[4]要求＜10%。②批间精密度：用室内质控品，每天检测1次，选取20天的室内质控的在控结果的变异系数作为评价指标，批间变异系数（CV%）需符合WS/T 494-2017要求＜15%。

1.4.2正确度（符合性实验） 因定量标准品难以获取，本实验室用已检测抗核抗体谱项目的卫生部室间质评样本作为验证材料，样本血清按试剂盒说明书进行常规步骤试验，结果再与免疫印迹法做符合性比对试验，阴性、阳性及弱阳性结果须完全相符。

1.4.3线性范围验证试验 采用CLSI EP6-A2[5]《定量分析方法的线性评价》验证方法，取一份低浓度ds-DNA样本（L）和一份高浓度ds-DNA样本（H）分别按照5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H的低高浓度配比，配成6个浓度梯度样本，按试剂盒说明书进行常规步骤试验。将6对实测值（Y轴）与预期值（X轴）进行直线回归，计算y=ax+b，计算线性范围和相关性，以R2≥0.95为判定标准。

1.4.4最低检出限 取一份低浓度标本重复做10次试验，按试剂盒说明书进行常规步骤试验。求空白检测低限（LoB）：将空白样品重复10次作批内测定，计算空白（响应量）均值（空白）和标准差（s空白），95%可能性为：LoB=x空白+2·s空白。

取稀释液作为标本重复做10次试验，按试剂盒说明书进行常规步骤试验。

求定量检测低限（LoQ）：将定量检测限样品重复10次作批内测定，计算响应量均值（）和标准差（s定量），95%可能性为：LoQ=定量+2·s定量。

1.4.5参考区间 参考CLSI C28-A2[6]，选取我院门诊体检正常人20名，男、女各10名，年龄在18-60岁之间，样本血清无黄疸及溶血，按试剂盒说明书进行常规检测，判断标准为R值≥90%，若满足要求，则可判定厂家提供的参考区间适用于本实验室，若不满足要求，则需根据本实验室建立参考区间。按以下公式计算R值：R＝检测值在引用参考区间的个体数／总个体数×100%。如果≥90%的样本检测结果在（1-119AU/ml）范围内，则验证符合通过。

1.5统计学分析 采用Microsoft Excel 2013软件进行数据分析处理。并计算相应的均值、CV和标准差。线性验证中各浓度理论值与实测值关系采用Pearson相关分析。计数资料以例数或百分率表示。

2 结果

2.1精密度验证结果 混合血清批内精密度均＜10%，质控血清批间精密度均＜15%，符合WS/T 494-2017要求的标准，见表1、表2。

表2 流式荧光免疫法检测15个自身抗体项目的批间精密度验证结果

2.2正确度验证 因定量标准品难以获取，本实验室用已检测ENA项目的卫生部室间质评样本作为验证材料，样本血清按试剂盒说明书进行常规步骤试验，结果再与免疫印迹法做符合性比对试验，阴性（＜100）、阳性（＞120）及弱阳性（100-120），结果完全相符，见表3。

表3 流式荧光免疫法检测自身抗体的正确度性能评价结果

2.3线性范围验证 因本实验室使用的美国ZEUS公司AtheNA系统Luminex200流式荧光分析仪检测ENA谱（抗核抗体谱）的结果只有ds-DNA项目是定量（IU/ml），其余项目为半定量（AU/ml），故此仅对ds-DNA的线性范围性能做评价。ds-DNA在美国ZEUS公司AtheNA系统Luminex200流式荧光分析仪检测结果在范围内呈线性，R2=0.9871，R2＞0.95，符合要求，见表4。

表4 流式荧光免疫分析法ds-DNA线性范围性能评价结果

2.4最低检出限验证 ENA谱15项检测试剂盒（多重微球流式免疫荧光发光法）在美国ZEUS公司AtheNA系统Luminex200流式荧光分析仪上最低检测限预期值为12，15项检测均低于预期值，见表5。

表5 流式荧光免疫分析法检测自身抗体检出限(灵敏度)结果

2.5参考区间验证结果 使用的美国ZEUS公司AtheNA系统Luminex200流式荧光分析仪检测ENA谱参考区间验证结果见表6，15项检测结果≥90%的样本检测结果在试剂盒规定的参考区间（1-119AU/ml）范围内，故参考区间验证符合通过。

表6 流式荧光免疫分析法检测自身抗体参考区间验证结果

3 讨论

近年来由于临床经验的积累和实验室诊断技术的进步，发现自身免疫性疾病患者越来越多，涉及临床多学科，相互交叉、相互渗透，临床表现复杂多样，同病异症，异症同病也是该类疾病容易误诊的主要原因之一。抗核抗体为一种广泛存在于人体内的自身抗体，可与细胞核产生反应，主要分布在血清内，通过其水平检测，可为自身免疫性疾病诊断提供一定指导[7]，自身抗体是用于辅助诊断自身免疫性疾病（AID）的重要实验室指标，其检测方法已不同程度实现了定量或半定量[8]。目前，比较公认的血清自身抗体检测的“金标准”是ANA HEp-2 IFA检测法，但是该方法只能作为初筛试验，而且主要依靠主观判断抗体的滴度，对于阳性的标本还需要做一系列的确证试验。因此，对于阳性标本，其检测步骤繁琐，检测成本高，报告周期长。因此，迫切需要一种能集初筛和确诊试验于一体的简便、快速的自身抗体检测法[9]。美国ZEUS公司AtheNA系统Luminex200流式荧光分析仪诊断系统采用多重微球流式点阵分析（multiplexed bead assay，MBA）技术研制的AtheNA Multi-Lyte抗核抗体检测系统是一种均匀的、多元的微珠分析系统[10]。有国内外文献报道，AtheNA ANA系统和标准的ELISA系统在检测确诊的自身免疫患者、实验室常规送检的连续标本以及献血者血清时，其符合率从97.7%-99.0%，单个标志物的符合率从92.09%-97.7%，具有高度一致性，其敏感性、特异性都很好[11]。在临床检验中，精密度是试剂盒或检验程序重要的分析性能之一，是保证准确度的先决条件，临床实验室绝不希望同一样本在不同时间测量的结果有明显差异，致使临床医生无法相信临床实验室的检验结果，从而使检验结果不能成为诊断和治疗的依据[12-13]。

正确度（符合性）是表示测量结果中系统误差大小的程度。本实验室用已检测抗核抗体谱项目的卫生部室间质评样本作为验证材料，符合性实验验证相对CV在0.37%-7.48%；结果再与免疫印迹法做符合性比对试验，阴性、阳性及弱阳性结果完全相符。说明该试验正确度性能符合要求。

多重微球流式免疫荧光发光法检测的ds-DNA浓度范围为12-649IU/mL，线性相关性好，R2=0.9871，说明该仪器具有良好的线性范围。最低检出限是对单位浓度或单位量待测物质变化所致的响应量变化程度，是试验方法产生一个能可靠地被检出的分析信号所需的被测组分的最小浓度或含量。参考区间是解释检验结果，分析检验信息的一个基本尺度和依据[14]，只有实验室给临床提供检验项目可靠的生物参考区间，才能使临床对患者或健康体检者的诊断治疗有明确的指引。按照CLSI C28-A2文件推荐的方法，对抗核抗体谱15个项目参考区间进行方法学验证，测定结果提示，SSA-52、SSB、Cent B有95.0%的测定数据在厂家引用的参考区间内，SSA-60、Sm、RNP、Scl-70、Jo-1、ds-DNA、Nucleosome、PM-Scl、PCNA、Ribosomal P、Histone、M2有100%的测定数据在厂家引用的参考区间内，均大于90.0%的要求，表明厂家提供的参考区间适合本实验室，可以直接引用。

综上所述，AtheNA系统Luminex200流式荧光分析仪诊断系统其精密度、正确度（符合性）、线性、检测限、参考区间均达到所要求的性能指标，性能能够满足临床需求，为自身免疫性疾病相关特异性抗体的检测提供了一种灵敏而特异的工具。