‘蛇龙珠’葡萄果实糖酸含量和代谢关键酶活的变化

摘要 糖酸是决定葡萄品质及葡萄酒风味的重要指标之一。本研究以酿酒葡萄‘蛇龙珠为试验材料，在其生长发育过程中的E-L 33、35、36、37和38这5个时期，测定和分析了果实生长发育过程中可溶性糖（葡萄糖、果糖）、主要有机酸（酒石酸、苹果酸）和游离氨基酸的动态变化，并分别测定了果实中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性的变化。结果表明，‘蛇龙珠果实在生长发育过程中葡萄糖和果糖逐渐增加；精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丙氨酸等游离氨基酸含量逐渐增加；主要有机酸酒石酸和苹果酸含量逐渐下降，PEPC酶的活性在E-L 35时期后表现出与果实中苹果酸含量相似的变化趋势，表明葡萄果实中苹果酸的降解可能受PEPC酶的影响。通过对有效成份含量的研究，更深入地了解葡萄果实的发育过程，并为优化葡萄酒酿造和调整香气特性提供参考。

关键词 ‘蛇龙珠；酒石酸；苹果酸；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶

中图分类号 S312 文献标识码 A  文章编号 1007-7731（2024）07-0099-05

Changes of sugar and organic acid contents and key enzyme activities during the growth and development of Cabernet Gernischt berries

YANG Congdi

（Ningxia Technical College of Wine and Desertification Prevention， Yinchuan 750001， China）

Abstract Sugar and organic acids play a crucial role in determining grape quality and wine flavor. This study aimed to investigate the dynamic changes in sugar （glucose， fructose） and organic acid （tartaric acid， malic acid） accumulation during grape fruit growth and development respectivly. Additionally， the activities of fruit phosphoenolpyruvate carboxylase （PEPC） and phosphoenolpyruvate carboxykinase （PEPCK） were examined at different developmental stages （E-L 33， 35， 36， 37， and 38）. The results demonstrated a gradual increase in free amino acids， glucose， and fructose concentrations. Conversely， the content of tartaric acid and malic acid declined throughout grape berry development. Furthermore， the PEPC enzyme activity displayed a similar pattern of change to that of malic acid content after the E-L 35 stage. Hence， it could be inferred that the breakdown of malic acid in grape berries is regulated by PEPC.By studying the bioactive component content， could gain a deeper understanding of the development process of grape fruits and provide reference for optimizing wine making and adjusting aroma characteristics.

Keywords Cabernet Gernischt; tartaric acid; malic acid; phosphoenolpyruvate carboxylase; phosphoenolpyruvate carboxykinase

在葡萄栽培和酿酒过程中，葡萄果实中的糖酸平衡尤为重要。可溶性糖的含量赋予葡萄浆果的甜度和丰富度，而有机酸则为浆果提供酸度和清新感，使其更加爽口[1]。适宜的糖酸平衡可以使葡萄浆果呈现丰富且平衡的口感，提升其品质。在葡萄酒酿造过程中，糖和酸各自的含量直接决定了酒的甜度和酸度。如果糖酸平衡失调，会导致葡萄酒过甜或过酸，影响口感和平衡度。此外，糖酸平衡还影响葡萄浆果的生长和发育。适宜的糖酸平衡有助于维持葡萄果实的膨胀、颜色、风味和酚类化合物的积累等正常的生理过程。葡萄果实含有大约20种不同的有机酸，其中酒石酸和蘋果酸是葡萄果实中的主要有机酸，占葡萄总酸度的90%以上。苹果酸（2-羟基丁二酸）在生物系统中普遍存在，其是糖酵解、三羧酸循环、乙醛酸循环和草莽酸等代谢途径的中间产物，也是C4类植物（包括景天酸代谢植物）重要的光合作用产物[2]。在植物中，苹果酸参与调节气孔的开度，平衡细胞的能量供应，调控细胞质的pH，增强植物的抗逆性，以及与代谢途径有更复杂联系的其他过程。果实中苹果酸的含量与其合成、降解和分隔的净平衡密切相关，果实有机酸的积累与植物的遗传背景及生长过程中的环境条件密切相关[3]。因此，通过研究酿酒葡萄‘蛇龙珠果实发育过程中有机酸含量的变化，分析苹果酸代谢关键酶活性，可以为阐明苹果酸的代谢提供参考。

游离氨基酸是葡萄果实中产生的主要代谢产物之一。从葡萄酒酿造角度来看，氨基酸代谢至关重要，因为其是许多关键挥发性香气化合物的前体物质。葡萄果实中氨基酸含量在不同品种和产区可能会有不同的变化模式[4]。本研究通过测定‘蛇龙珠葡萄果实中的水溶性糖、有机酸和氨基酸含量，了解各有效成分含量在果实生长发育过程中的变化规律。通过对有效成分含量的研究，更深入地了解葡萄果实的发育过程，并为优化葡萄酒酿造和调整香气特性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2023年4—9月在宁夏贺兰山东麓玉泉营农场进行。试验材料为长势基本一致，且无病害的六年生‘蛇龙珠，单干双臂整形方式，株行距0.8 m × 3.0 m。利用Eichhorn-Lorenz（E-L）系统，分别于E-L 33、35、36、37和38这5个时期进行果实样品的采集，并进行相关指标的测定。

1.2 试验方法

1.2.1 取样方法  取样时间为上午8—9时，在设有保护行的试验地，于每个果穗前、后、左和右4个面的上、中、下3个位置随机均匀取样，共取150粒。剪去果梗，用于测定果实鲜重，取50颗果粒压榨成汁，测定可溶性总固形物（TSS）、可滴定酸含量及pH值。其余果实样品用液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存，用于其他指标的测定。

1.2.2 果实品质指标  葡萄果实鲜重使用1/104电子天平测定，TSS采用手持折光仪进行测定，果实TA含量采用氢氧化钠滴定法（0.05 M）测定，葡萄汁pH值使用雷磁pH计进行测定。

1.2.3 可溶性糖、有机酸和氨基酸的测定  去除葡萄果实的果梗和种子后，用液氮将其研磨成粉末状，准确称取1 g，加入9 mL超纯水，20 °C下超声提取30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液经0.45 μm的滤膜过滤，采用UltiMate 3000型高效液相色谱仪（Thermo Fisher科技有限公司）进行测定。

可溶性糖测定高效液相色谱条件：示差检测器，色谱柱Hypersil GOLDTM Amino色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 ?m）；流动相为乙腈∶水（V/V） = 75∶25；检测波长245 nm；流速0.5 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 ?L。

有机酸测定高效液相色谱条件：色谱柱型号C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；紫外检测器（210 nm），流动相为97% 10 mmol/L的磷酸二氢钾（pH 2.7）和3%的甲醇；流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 ?L。

氨基酸的衍生化：使用经过相同衍生化程序的氨基酸标准品计算氨基酸含量。氨基酸测定高效液相色谱条件：色谱柱型号C18（250 mm × 4.6 mm，5 ?m）；紫外检测器（280 nm）；A相10 mM磷酸氢二钠/硼砂，pH 8.4；B相乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10（V/V/V）；流速1.2 mL/min；柱温16 ℃；进样量5 μL。洗脱程序为2% B保持0.5 min，2%～57% B保持24.5 min，57%～100% B保持0.1 min，3.4 min，2%～100% B保持0.1 min，保持1.4 min。

1.2.4 有机酸代谢关键酶活含量的测定  磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（PEPCK）的前处理和活性测定主要参考Sweetman等[5]的方法。称取5 g去除果梗和种子的葡萄果实粉末，加入20 mL提取缓冲液[内含500 mM pH 8.5 Tris-Cl、200 mM氯化钾、20 mM氯化镁、10 mM乙二胺四乙酸、8%（w/v）PEG-2000、8 mM盐酸半胱氨酸、5 mM二硫苏糖醇、2%（w/v）交联聚乙烯吡咯烷酮、0.25%（w/v）牛血清白蛋白、0.5 mM苯甲磺酰氟和0.5 mM 4-氨基苯甲酰胺]于冰上充分研磨，研磨的匀浆全部加入50 mL离心管后进行离心（3 000 g，10 min），收集上清液于新的离心管，加入聚乙二醇-2000，使其终浓度为40%（w/v），在室温下轻轻混合，直到聚乙二醇-2000完全溶解后离心（30 000 g，15 min），加入5 mL重悬液（内含5 mM pH 7.0 Tris-Cl、20 mM氯化镁、10 mM乙二胺四乙酸、5 mM二硫苏糖醇、3%（v/v）Triton X-100、0.5 mM苯甲磺酰氟和0.5 mM 4-氨基苯甲酰胺）对沉淀的蛋白进行重悬后离心（5 000 g，1 min），以上上清液立即用于酶活性的检测。

1.3 数据分析

利用Excel 2016进行数据分析，利用Origin 2022和TBtools-II进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 品质指标

从表1可以看出，随着葡萄果实的生长发育，‘蛇龙珠葡萄果实鲜重呈稳步增加的趋势。E-L 35—36时期和E-L 37—38时期浆果鲜重明显增大，果粒重量增加迅速，单粒浆果鲜重分别增加0.408 4和0.292 2 g。葡萄浆果的总可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）变化趋势相反，TSS含量逐渐升高，但TA含量逐渐下降；E-L 35时期TSS增速最快，而TA含量下降速度最快，在E-L 35时期浆果可溶性糖含量得到了迅速積累。随着葡萄的生长发育，浆果pH值逐渐升高，但果汁样品pH值与相应的含酸量不一致。

2.2 可溶性糖含量

如图1所示，在‘蛇龙珠葡萄果实发育过程中，以积累果糖和葡萄糖为主，且均呈增长趋势。E-L 33时期葡萄浆果仍是绿色的和坚硬的，浆果果实主要积累有机酸（主要是酒石酸和苹果酸），仅有很少的糖（果糖和葡萄糖含量分别为5.716和7.573 mg/L）。浆果在E-L 35时期开始变色和软化，并快速积累果糖和葡萄糖，在E-L 36时期以具有白利糖度的中值为特点，在E-L 38时达到收获成熟度，与E-L 35时期相似，其果糖含量（85.369 mg/L）仍高于葡萄糖（70.631 mg/L）。

2.3 有机酸含量

‘蛇龙珠葡萄浆果在E-L 33—38时期酒石酸和苹果酸的含量变化如图2所示。酒石酸和苹果酸在果实生长发育过程中变化趋势相似，均是迅速积累后急速下降，再转为缓慢下降，并持续到浆果成熟。在E-L 33—38时期，果实中酒石酸含量下降了11.374 mg/L，蘋果酸含量下降了14.927 mg/L。

2.4 有机酸关键代谢酶活性

‘蛇龙珠浆果发育过程中有机酸关键代谢酶活性的变化如图3所示。由图3（A）可知，‘蛇龙珠葡萄果实在不同时期磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性呈先升高再降低趋势，E-L 33时期PEPC酶活性为35.50 nmol/g FW，此后逐渐升高，E-L 36时期达到最高（88.05 nmol/g FW）。随后，随着果实逐渐成熟，其活性呈下降趋势，在E-L 38时期PEPC酶活性为65.45 nmol/g FW，这表明浆果中PEPC酶活性成熟期高于绿果期。由图3（B）可知，浆果中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PEPCK）活性远远小于PEPC酶活性，且在E-L 38时期更为明显。在‘蛇龙珠浆果生长发育过程中，PEPCK酶活性最高为20.40 nmol/g FW。

2.5 不同氨基酸含量

如图4所示，精氨酸在E-L 33-38时期的含量呈明显增加的趋势，脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丙氨酸在果实生长发育期也表现出明显的增加趋势。在E-L 33—38时期，甘氨酸和谷氨酸的含量经历了较大变化。相比之下，天冬氨酸和赖氨酸在E-L 33—38时期的变化较小。可见，在‘蛇龙珠浆果的发育过程中，不同氨基酸的含量呈现出不同的变化趋势。

3 结论与讨论

‘蛇龙珠浆果的发育伴随着重量体积的增大、糖分的积累以及酸分的下降，最后达到糖酸平衡，浆果进入成熟期。可溶性固形物和可滴定酸含量与葡萄果实和葡萄酒的品质直接相关[6]，二者是葡萄品质的关键因素。成熟浆果中的糖分通常占可溶性固形物含量的90%以上，蔗糖是葡萄中主要的转运糖之一，但其在浆果中的含量较低[7]，各个时期葡萄浆果中的可溶性糖主要由葡萄糖和果糖组成。

葡萄果实中的有机酸包括酒石酸、苹果酸和柠檬酸等，其对葡萄果实的风味和品质起着重要作用。在葡萄浆果的生长初期到成熟的过程中，有机酸是通过糖异生、三羧酸循环和莽草酸循环生成的。葡萄发育过程中酸度的增加是各种代谢过程的综合结果，其中，苹果酸和酒石酸占总酸的90%以上。酒石酸在葡萄中比苹果酸稳定得多，且酒石酸和苹果酸均由糖转化而来。与苹果酸相似，大多数酒石酸是在转色前期合成，但是其生物合成与代谢途径却存在差异。酒石酸是葡萄糖和抗坏血酸代谢的次级代谢产物[8]。转色后期酒石酸含量的降低主要是由于浆果中糖分和水分的稀释。与苹果酸不同的是，酒石酸在整个生长过程中很少会被降解，仅有微量酒石酸被呼吸代谢。

苹果酸是葡萄果实中的主要有机酸，且参与细胞内大量有机物的转化。PEPC酶是果实苹果酸代谢中的关键酶，能将磷酸烯醇式丙酮酸缩合成草酰乙酸[9]。葡萄浆果中，其活性变化主要在转色后期，与苹果酸含量积累变化一致。相关研究表明，葡萄果实中，PEPC酶活性的降低与CO2的暗固定以及糖酵解通量的减少密切相关，推测PEPC酶可能参与光合作用及糖分降解等过程[10]。‘蛇龙珠浆果发育过程中，PEPC酶活性经历E-L 35时期后，表现出与苹果酸含量相似的变化趋势。这说明在葡萄果实中，苹果酸的降解受PEPC酶的调控。在高等植物中，PEPCK是一种胞质酶，催化草酰乙酸脱羧生成磷酸烯醇式丙酮酸。PEPCK是主导苹果酸降解的关键酶，参与了几种果肉中苹果酸的异化，并可能与低酸苹果品种中苹果酸的缺乏有关。

在不同生长阶段和果实部位的氨基酸含量在种植地区和栽培条件等因素的影响下，可能存在一定的差异[11]。因此，了解‘蛇龙珠浆果氨基酸含量变化规律对其适宜的生长管理和采摘时间的确定具有一定参考价值。

综上，本研究以酿酒葡萄‘蛇龙珠为试验材料，在其生长发育过程中的E-L 33、35、36、37和38这5个时期，测定和分析了果实生长发育过程中可溶性糖（葡萄糖、果糖）、主要有机酸（酒石酸、苹果酸）和游离氨基酸的动态变化，并分别测定了果实中有机酸关键代谢酶PEPC和PEPCK活性的变化。结果表明，‘蛇龙珠果实在生长发育过程中葡萄糖和果糖逐渐增加；精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丙氨酸等游离氨基酸含量逐渐增加；主要有机酸酒石酸和苹果酸含量逐渐下降，PEPC酶的活性在E-L 35时期后表现出与果实中苹果酸含量相似的变化趋势，表明葡萄果实中苹果酸的降解可能受PEPC酶的影响。通过对氨基酸含量的研究，更深入地了解葡萄果实的发育过程，并为优化葡萄酒酿造和调整香气特性提供参考。

参考文献

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[2] 牛生洋，刘崇怀，刘强，等. 葡萄种质果实有机酸组分及其含量特性[J]. 食品科学，2022，43（12）：228-234.

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[11] 陈华伟，乐小凤，张振文. 不同棚膜颜色对赤霞珠葡萄果实氨基酸含量的影响[J]. 中国酿造，2021，40（3）：143-148.

（责编：杨 欢）

基金项目 宁夏回族自治区高等学校科学研究项目（NYG2022230）。

作者简介 杨从弟（1987—），男，甘肃静宁人，助教，从事林产化工研究。