胎儿生长受限孕妇胎盘自噬相关蛋白表达水平及其临床意义

张玉苓，张 珂，许 艇，张 庆

郑州大学第二附属医院 妇产科，河南 郑州 450014

胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)是指女性在妊娠期间,腹中胎儿因各种因素生长发育未达标准,胎儿体质量低于同孕龄平均体质量的第10百分位,或低于同孕龄平均体质量的2个标准差[1]。FGR增加了围产期发病率和死亡率,其中57%不明原因的死亡认为与FGR有关[2]。但目前临床关于FGR的病因、病理机制,多认为与母体宫内环境因素异常导致的胎盘功能障碍有关[3]。有研究发现,由于胎盘的功能性异常,引起滋养细胞自噬[4],进而导致FGR,但关于滋养细胞自噬在FGR中具体的形成和调控机制尚无明确的报道。Beclin-1、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 ligh chain 3,LC3)是自噬蛋白中类型代表,其中Beclin-1是自噬前体细胞膜合成与生长的最早复合体,LC3是自噬体膜构成的关键蛋白,Beclin-1和 LC3在妊娠期糖尿病患者中有较高的表达,与妊娠期糖尿病患者不良妊娠结局有关[5],但Beclin-1和 LC3在FGR中的表达尚不清楚。鉴于此,本研究旨在探讨胎儿FGR孕妇胎盘自噬相关蛋白Beclin-1、LC3表达水平及其临床意义,探讨自噬与FGR发病的内在关系。

1 材料与方法

1.1 资料

1.1.1 病例来源:选取2022年8月至2023年8月于郑州大学第二附属医院因FGR分娩的孕妇胎盘组织40例作为研究对象,年龄18～38岁;孕次1～3次;孕前体质量47～68 kg;孕周37～41周。纳入标准:符合FGR临床诊断标准[6],单胎、孕周明确、足月。排除标准:合并严重肝肾功能损伤和免疫细胞疾病;胎儿畸形;有FGR家族史和既往史。另选取同期正常分娩的孕妇胎盘组织40例为健康组,健康组病例排除内外科疾病和产科并发症。此次研究为回顾性研究,经郑州大学第二附属医院伦理审批通过,伦理审批号(2021242)。孕妇及家属知情同意。

1.1.2 临床资料收集:根据本次研究目的收集孕妇临床资料,记录入组孕妇年龄、孕次、孕前体质量、分娩孕周、胎盘厚度、胎盘质量和新生儿体质量等。

1.1.3 试剂(盒):RNA提取试剂盒(天根生化科技公司);GAPDH引物(宝生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 胎盘样本的处理:所有入组孕妇均于分娩后留取胎盘组织中央组织2 cm×2 cm×2 cm组织块,常规行0.9%氯化钠注射液进行漂洗,后取其中小部分行多聚甲醛灌注取材后固定12 h,蒸馏水冲洗3次后置于乙醇中,行脱水、包埋和切片处理。

1.2.2 RT-qPCR法检测胎盘组织中Beclin-1、LC3 mRNA水平:以RNA提取试剂盒进行RNA提取,后将提取的RNA反转录为cDNA行qRT-PCR反应。以GAPDH为内参基因。采用2-ΔΔCt法计算Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量。Beclin-1上游引物5′-AGTGGCGGCTCCTATTC-3′、下游引物5′-GGACACC CAAGCAAGAC-3′;LC3上游引物5′-TTCGCCGACC GCTGTAA-3′、下游引物5′-ATCCGTCTTCATCCTT CTCCT-3′。GAPDH上游引物:5′-AGTGGCAAAGTG GAGATTGTTG-3′;下游引物:5′-CAGTCTTCTGGGTG GCAGTGAT-3′。

1.2.3 免疫组化法检测Beclin-1、LC3蛋白表达:石蜡标本切片后,甲苯脱蜡-酒精脱蜡-PBS清洗-抗原修复后,封闭。以细胞质或细胞核内出现黄色为阳性。采用免疫反应积分法(IRS)评价染色结果,占比0～<25%、25%～<50%、50%～<75%和≥75%分别为1分～4分。阳性细胞染色强度评分:无染色、浅黄色、黄褐色和棕褐色分别为0分、1分、2分和3分。IRS=阳性细胞百分比评分和阳性细胞染色强度评分之积,以IRS≤3分为阴性,>3分为阳性。

1.2.4 观察指标:比较FGR组与健康组一般资料、胎盘厚度、胎盘质量和新生儿体质量;比较FGR组与健康组自噬相关蛋白Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平和蛋白表达情况;比较胎盘组织Beclin-1、LC3阳性蛋白表达在不同资料FGR患者中差异。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 FGR组与健康组一般资料比较

FGR组与健康组在年龄、孕周等方面比较无统计学显著性差异(表1)。

表1 FGR组与健康组一般资料比较Table 1 Comparison of general data between FGR group and healthy n=40)

2.2 FGR组与健康组胎盘厚度、胎盘质量和新生儿体质量比较

FGR组与健康组在胎盘厚度、胎盘质量和新生儿体质量方面均有差异(P<0.05)(表2)。

表2 FGR组与健康组胎盘厚度、胎盘质量和新生儿体质量比较

2.3 FGR组与健康组自噬相关蛋白Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平比较

FGR组Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平均高于健康组(P<0.001)(图1)。

FGR. fetal growth restriction; *P<0.001 compared with the healthy group.

2.4 FGR组与健康组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3阳性表达比较

FGR组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3阳性表达率均显著高于健康组(P<0.05)(图2,表3)。

A.Beclin-1 expression in health group; B.Beclin-1 expression in FGR group; C.LC3 expression in health group; D.LC3 expression in FGR group.

表3 FGR组与健康组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3阳性表达比较

2.5 FGR孕妇中胎盘组织Beclin-1、LC3蛋白阳性表达不同临床资料比较

FGR孕妇中胎盘组织Beclin-1、LC3蛋白表达阳性率在胎盘厚度、胎盘质量、新生儿体质量比较上,差异均有统计学意义(P<0.05);在产后大出血、羊水过多和胎儿窘迫比较上无统计学意义(P>0.05)(表4)。

表4 FGR孕妇中胎盘组织Beclin-1、LC3蛋白阳性表达不同临床资料比较

3 讨论

研究显示,孕妇在妊娠期营养不足,或有妊娠并发症,是影响胎儿生长的危险因素[7]。本次研究结果显示,FGR组胎盘厚度、胎盘质量和新生儿体质量水平均较低,与既往报道一致[8]。由于临床对于FGR的早期监测指标尚无权威的研究,故有必要寻求可靠的生物学指标。

本研究发现,FGR组Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平均较高。Beclin-1蛋白作为酵母自噬基因Atg6的同源基因,Bcl-2结合部位、螺旋-螺旋结构域和进化保守结构域均是其主要功能位点[9]。LC3是酵母菌自噬基因Ap98在哺乳动物中的同源物[10]。在自噬体形成过程中,Beclin-1可以引导相关蛋白定位,同时依赖Beclin1-PI3KC3复合体参与形成自噬体,该复合体中还同时包括Atg14。自噬体双层膜结构的形成是Atg14与Beclin-1相互作用的结果,是自噬形成的关键起始阶段。其中LC3是自噬体形成的生物标志,Beclin-1则可与其他蛋白结合共同调节自噬体形成[11]。分析本研究结果变化,可能是由于胎盘自身发育异常等因素,限制了营养物质摄取和转运,导致胎盘灌注不足,使滋养细胞及蜕膜细胞凋亡。正常的自噬可以参与细胞的增殖分化,而过度自噬会引发滋养细胞的内皮功能紊乱,引发胎盘功能障碍[12]。本次研究发现,FGR组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3阳性表达率,及不同胎盘厚度、胎盘质量、新生儿体质量阳性表达率比较上均有差异。分析其机制可能是由于Beclin-1、LC3抑制了胎盘滋养细胞增殖、侵袭,使胎盘组织被过度激活,诱导并促进自噬,以此影响胎盘的发育及功能,参与FGR疾病进展。

综上所述,FGR孕妇胎盘组织中自噬基因Beclin-1、LC3阳性表达情况与胎儿发育水平有关,临床可以通过Beclin-1、LC3检测为评估FGR提供一定参考。