软骨细胞中生物钟基因Bmal1对细胞周期相关基因表达的影响

杨春生，王添兴，张铁成，武恒敏，王宝兰*

新疆医科大学第一附属医院 1.康复医学科；2.关节外科，新疆 乌鲁木齐 830000

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种严重危害人类身心健康的慢性退行性关节疾病。既往研究报告指出,到2020年全球40岁以上人群的患病率为22.9%[1]。除了个人负担外,骨关节炎的社会经济成本也是相当可观的。据报道,骨关节炎是影响70岁以上人群残疾生活年限的十大主要病因之一,影响了这个年龄组三分之一的人,并且在所有年龄段中排名第14位[2]。已知OA的发病由多种因素引起。本文关注到生物钟和细胞周期紊乱会导致许多亚健康状况和疾病,如肥胖、糖尿病、骨关节炎和心血管疾病等[3]。

生物钟(biological clock)昼夜节律周期和细胞周期(cell cycle)是机体的两个基本的生命周期,周期在1 d范围内,可相互影响。生物钟基因可驱动软骨稳态关键基因如MMP13、COL2A1和IHH的节律性表达,并可直接或间接控制多个细胞周期基因的表达,如WEE1、CDKN1A、Cyclin E 和Cyclin B等。与生物钟昼夜节律周期类似,细胞周期也是一个严格调控的系统,细胞周期调节蛋白异常,可影响细胞周期正常进程,从而引发疾病,如CCND1、CDK1和CCNB1、WEE1、CDKN1A蛋白表达异常,可影响软骨细胞正常分裂、增殖和分化,引起细胞凋亡,发生骨关节炎[4]。然而,软骨细胞中时钟基因Bmal1和细胞周期的内在平衡关系,调控细胞周期的机制并不是完全清楚。本文主要探讨软骨细胞中Bmal1和细胞周期相关基因的关系,及其对细胞周期的调控作用,进一步探究和OA发病相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞: 小鼠畸胎瘤 ATDC5细胞系,用于软骨分化诱导(南京科佰生物科技有限公司)。

1.1.2 试剂及试剂盒 :DMEM/F12 培养基(Gibco公司);胎牛血清(BioInd公司);胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin-transfering-selenium, ITS,Sigma-Aldrich公司);IL-1β(PeproTech Inc公司);LV-Bmal1(21735-1)和病毒感染试剂(上海吉凯基因技术有限公司);一抗(武汉三鹰生物技术有限公司);β-actin、细胞周期检测试剂盒(武汉塞维尔生物科技有限公司);蛋白裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒和annexin PE/7-AAD凋亡检测试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司);引物(上海生工生物工程股份有限公司);SYBR Green PCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 ATDC5细胞的培养与诱导: 将ATDC5细胞置于含10%胎牛血清、1%青链霉素的完全培养基(DMEM/F12)中,在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞汇聚度达到 30%～40% 时,将完全培养基替换成含有ITS的诱导培养基,进行ATDC5细胞的成软骨诱导[5]。每2 d更换诱导培养基1次, 诱导培养14 d成为软骨样ATDC5细胞。连续诱导培养的0、7、14和21 d,通过PCR测定诱导的ATDC5细胞内Ⅱ型胶原(collagen type Ⅱ, Col Ⅱ)和Ⅹ型胶原(collagen type Ⅹ, Col Ⅹ)的mRNA表达情况,明确软骨样ATDC5细胞诱导是否成功。将ITS诱导培养基更换为含有IL-1β的完全培养基,IL-1β的浓度为10 ng/mL,诱导培养24 h成为OA软骨样ATDC5细胞。PCR检测IL-1β诱导后细胞Il-6、Tnf-α的mRNA表达量,确定OA软骨样ATDC5细胞诱导成功。

1.2.2 稳定感染BMAL1慢病毒的软骨样ATDC5细胞株建立和诱导:ATDC5细胞成软骨诱导过程中,按照上海吉凯基因技术有限公司推荐的方案,根据感染复数(multiplicity of infection, MOI),待细胞汇聚度达到 30%,加入相应剂量的病毒和感染增强试剂。48 h后细胞汇聚度达到 80%～90%,荧光显微镜下观察细胞荧光情况。细胞明显感染病毒后加入嘌呤霉素,浓度为 3 μg/mL,进行稳定感染病毒的细胞筛选,传代后用于后续实验。PCR检测感染后细胞Bmal1的mRNA表达量,评估感染效果。

1.2.3 细胞分组:将ITS诱导的软骨样ATDC5细胞设定为正常组(normal),OA软骨样ATDC5细胞为骨关节炎组(osteoarthritis,OA), 慢病毒Bmal1过表达的软骨样ATDC5细胞设定为慢病毒Bmal1组(LentivirusBmal1,LV-Bmal1)。

1.2.4 CCK8法:将细胞按实验分组接种于96孔板中(100 μL/孔) ,每孔加入10 μL的 CCK-8溶液,于培养箱中孵育1 h,用酶标仪测定各组细胞在 450 nm处的吸光度。

1.2.5 RT-qPCR :将各组ATDC5细胞提取的mRNA逆转录为cDNA,进行基因扩增。根据Bmal1、Wee1、Per1、Cdk1、Ccnb1、Mmp13检测结果的Ct值,计算相对表达量后分组比较,并根据mRNA的表达量,进行相关性分析。

1.2.6 Western blot:各组的ATDC5细胞采集后加入RIPA裂解液和蛋白质磷酸酶抑制剂,在冰上提取细胞总蛋白,BCA试剂盒测定蛋白质浓度。电泳分离、转膜、5%脱脂奶粉封闭后添加一抗,在4 ℃下过夜。第2天,加二抗孵育、化学发光成像。用Image J软件进行灰度值分析,计算蛋白质相对表达量。

1.2.7 流式细胞测量术检测细胞周期和凋亡

1.2.7.1 细胞周期检测:将细胞和细胞悬液加入15 mL离心管,离心收集细胞后,用预冷的75%乙醇重悬细胞,在4 ℃过夜固定。第2天,将过夜的细胞离心弃上清。加入1 mL的PBS混匀,离心后收集细胞并重悬。加入RNaseA后,37 ℃水浴30 min。加入的 PI染色液避光染色。流式细胞仪进行检测。

1.2.7.2 细胞凋亡检测:收集培养的细胞置于离心管内,离心沉淀细胞后吸除上清,加入预冷的 PBS重悬细胞,再次离心沉淀细胞,吸除上清;去离子水稀释结合缓冲液,用结合缓冲液重悬细胞,调节其浓度为1×106～5×106/mL,取 100 μL 的细胞悬液于流式检测管中,加入annexin V/PE 混匀后于室温避光孵育,加入7AAD和PBS,立刻检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ATDC5细胞的诱导和诱导后慢病毒感染验证

Ⅱ型胶原在ITS诱导后,第7天mRNA表达量明显增高,14 d达峰值,提示ATDC5细胞系向软骨分化的早期阶段。Ⅹ型胶原的mRNA表达量自诱导后逐渐增加,21 d时表达量达到峰值,提示ATDC5细胞系向软骨分化的晚期阶段(表1)。IL-1β诱导后的软骨样ATDC5细胞,Il-6、Tnf-α的mRNA表达量明显上升,出现炎性表型(P<0.05)(表2)。Bmal1慢病毒感染后的软骨样ATDC5细胞,Bmal1的mRNA表达量明显升高(P<0.05)(表2)。

表1 软骨样ATDC5细胞诱导Table 1 The inducted differentication of chondrocyte-like cell of ATDC5

表2 OA软骨样ATDC5细胞诱导和软骨样ATDC5细胞感染Bmal1过表达慢病毒

2.1 CCK8法检测细胞活力

相对于normal组,OA组细胞活力提高,LV-Bmal1组细胞活力下降,P值均≤0.05(表3)。

表3 CCK8细胞活力测定

2.2 RT-qPCR检测和相关性分析

在OA软骨样ATDC5细胞中,和normal组相比,OA组中Bmal1、Wee1的mRNA相对表达量下降,Per1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13的mRNA相对表达量明显增加;而LV-Bmal1组中Bmal1、Wee1的mRNA相对表达量升高,Per1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13的mRNA相对表达量下降(表4)。相关性分析显示,Bmal1与Wee1存在正相关,二者与Per1、Cdk1、Ccnb1、Mmp13存在负相关,Per1、Cdk1、Ccnb1、Mmp13之间存在正相关(图1),P值均<0.05。结果表明,Bmal1可能对Wee1有正向调控作用,对Per1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13有负向调控作用。

Red represents positive correlation; Blue represents negative correlation; 0-0.19.very weak correlation or no correlation; 0.2-0.39.weak correlation; 0.4-0.59.moderate correlation; 0.6-0.79.strong correlation; 0.8-1.0.highly correlated.

表4 Bmal1、Wee1、Per1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13的mRNA相对表达量Table 4 Relative mRNA expression of Bmal1, Wee1, Per1, Cdk1, Ccnb1 and

2.3 Western blot检测相关蛋白的表达

与normal组相比,OA组中BMAL1、WEE1相对表达水平下降,PER1、CDK1、CCNB1和MMP13相对表达水平增高; LV-Bmal1组中BMAL1 和WEE1相对表达强度升高,PER1、CDK1、CCNB1和MMP13相对表达水平下降(表5,图2),P值均<0.05。进一步验证了Bmal1对Wee1有正向调控作用,对Per1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13有负向调控作用。

图2 免疫印迹法检测BMAL1、PER1、CDK1、CCNB1、WEE1和MMP13的表达Fig 2 Western blot was used to detect the expression of BMAL1, PER1, CDK1, CCNB1, WEE1 and MMP13

表5 免疫印迹法半定量分析BMAL1、PER1、CDK1、CCNB1、WEE1和MMP13的表达

2.4 流式细胞术检测细胞周期和凋亡

和normal组比,OA组中S期和G2/M期缩短,细胞比例明显下降,早期和晚期凋亡细胞比例明显增加; LV-Bmal1组的S期和G2/M期延长,细胞比例增加,早期和晚期凋亡细胞比例下降(P<0.05)(表6,图3, 4)。

图3 流式细胞测量术检测不同处理的软骨样ATDC5细胞的细胞周期Fig 3 Flow cytometry was used to detect the cell cycle of chondrocyte-like ATDC5 cells treated with different methods

图4 流式细胞术检测不同处理后的软骨样ATDC5细胞的细胞凋亡Fig 4 Apoptosis of chondrocyte-like ATDC5 cells after different treatments detected with flow cytometry

表6 流式细胞术半定量分析细胞周期和凋亡Table 6 Semi-quantitative analysis of cell cycle and apoptosis by flow

3 讨论

BMAL1作为生物钟核心协调者,是调节生物节律的重要转录因子,对包括骨、软骨和牙齿在内的硬组织发育是不可或缺的,在间充质干细胞终末分化的骨细胞和软骨细胞中都有表达[6]。Bmal1可通过与Clock形成的复合物直接结合肿瘤细胞中Wee1基因启动子,而促进其转录,同时Bmal1可诱导肝脏中Wee1的 mRNA 合成, 促进Wee1的表达,当Bmal1敲除时,Wee1表达下调[7-8]。WEE1是G2检查点激酶-细胞周期调节因子,可通过介导Thr14和Tyr-15上 CDK1 的磷酸化位点,保护细胞核免受 CDK1-CyclinB1复合物的影响,充当有丝分裂(G2-M)的负调节因子。而CDK1和CCNB1常以复合物的形式共同调控细胞周期G2到M期转变,控制细胞周期进展,是细胞增殖、分裂、分化和凋亡的重要调节因子。正常情况下,DNA 损伤时,WEE1通过CDK1 磷酸化调节 G2/M 检查点来负性调节细胞进入有丝分裂,使细胞有充足时间修复受损的 DNA,为细胞提供有利的生存环境[9]。当WEE1 抑制时, G2/M 检查点的功能消失或缺陷,会使细胞无视是否存在 DNA 损伤,提前通过 G2/M检测点,进入程序外有丝分裂,导致有丝分裂灾难及细胞凋亡[10-11]。CDK1活性增加时,可以破坏Bcl-2家族蛋白的抗凋亡功能,细胞有丝分裂加快并部分转换为凋亡[12];而在星形胶质细胞和小胶质细胞中,下调CDK1的活性,可抑制神经元的自噬和凋亡[13]。此外,CCNB1的高活性可引起细胞周期紊乱,在有丝分裂时导致细胞死亡机制的激活[14]。本研究中发现,BMAL1在软骨细胞中可正向调控WEE1的活性,并间接负向影响CDK1和CCNB1的表达。当BMAL1表达下降时,WEE1的活性下降,G2检查点的功能减弱或消失,而CDK1和CCNB1保持高活性,细胞活力增加,此时细胞不能正常退出S期和G2/M期,DNA复制和有丝分裂期缩短,致使细胞周期进程加速,细胞损伤后没有充足时间修复,最终发生凋亡和转化的细胞增加,或继发有丝分裂灾难,细胞死亡、衰老加快。

综上所述,时钟基因Bmal1与细胞周期相关基因在OA中紧密耦合,在此次的研究中得到验证,并推测,BMAL1、WEE1可能为OA的保护因素,PER1、CDK1、CCNB1、MMP13可能为OA危险因素,它们共同影响OA的发生和进展。