和厚朴酚抑制人脂肪间充质干细胞增殖

李 娜，李 涛，杨冬梨，姚 媛

陕西中医药大学 1.基础医学院；2.第二临床医学院，陕西 咸阳 712046

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是中胚层来源的成体干细胞。研究表明MSCs是构成肿瘤微环境的重要基质成分,对肿瘤的发展有复杂的影响[1]。MSCs对肿瘤的促进作用通过多种机制实现,包括分化为其他促肿瘤成分如肿瘤相关成纤维细胞、抑制免疫细胞活性、促进血管生成、通过与肿瘤细胞直接接触或细胞因子及外泌体的分泌调控肿瘤细胞生物学功能,最终促进肿瘤细胞增殖和转移、抑制凋亡及增加肿瘤耐药性[2]。

和厚朴酚是从木兰属植物的根和茎皮中分离的生物活性成分,有效抗炎、抗氧化、抗衰老、镇痛和抗肿瘤等作用[3]。多项研究证实和厚朴酚可直接作用于肿瘤细胞,通过抑制其增殖和转移、促进凋亡等发挥抗肿瘤作用[4]。然而,和厚朴酚对肿瘤微环境的调节作用研究较少。本研究拟以人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hADSCs)为研究对象,观察和厚朴酚对其增殖、凋亡的影响及相关机制,为进一步明确和厚朴酚调控肿瘤微环境发挥抗癌效应奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

1.1.1 细胞: hADSCs获赠于中国医学科学院基础医学研究所赵春华课题组。

1.1.2 主要试剂:DMEM/F12培养基和胎牛血清(Gibco公司); MTS 试剂盒(Promega公司);台盼蓝染色液(翌圣生物科技有限公司);annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(BD Pharmingen公司);反转录及PCR扩增相关试剂(TaKaRa公司);引物(上海生物工程有限公司);qPCR SYBR Green Master Mix(翌圣生物科技有限公司); GAPDH抗体(武汉三鹰生物技术有限公司); BAX抗体、BCL2抗体、CYCLIND1抗体、PCNA 抗体、p-ERK抗体、p-MEK抗体、ERK抗体和MEK抗体(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTS实验: 按照试剂盒说明书进行,具体方法参见文献[5]。

1.2.2 台盼蓝染色液检测细胞活性:离心收集不同浓度和朴厚酚预处理的hADSCs,PBS清洗后制成单细胞悬液,按照1:1比例与台盼蓝染色液充分混匀,染色1～2 min后加入细胞计数板,细胞计数仪计数总细胞、死细胞和活细胞。

1.2.3 annexin V/PI检测细胞凋亡:按照试剂盒说明书进行,具体方法参见文献[5]。

1.2.4 RT-qPCR检测:Trizol裂解液提取不同浓度和朴厚酚预处理的hADSCs总RNA,两步法反转录为cDNA,加入引物、SYBR检测相关基因的表达,所用引物见表1。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.2.5 Western blot实验: 收取不同浓度和朴厚酚预处理hADSCs的蛋白样品,检测增殖、凋亡及MEK-ERK信号通路相关蛋白的表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 和厚朴酚抑制hADSCs增殖

采用不同浓度的和厚朴酚(0、5、10、20和50 μmol/L)处理hADSCs 48 h。MTS实验结果显示,与空白对照组相比,10、20和50 μmol/L浓度组细胞的活性均明显降低(P<0.01) (图1A),5 μmol/L对hADSCs活性几乎无影响。台盼蓝染色后计数结果显示,随着和厚朴酚浓度增加,hADSCs总细胞数、活细胞数以及活细胞比例逐渐下降(P<0.01) (图1B～D)。

The effect of honokiol at different concentrations on the proliferation of hADSCs;A.MTS assay; B-D.cell counts were performed by Trypan blue staining; *P<0.01,**P<0.001 compared with 0 μmol/L group.

随后采用RT-qPCR和Western blot检测不同浓度和厚朴酚(0、10、20和50 μmol/L)处理hADSCs 48 h后对增殖相关基因表达水平的影响。随着和厚朴酚浓度增加,增殖相关基因CCND1、MKI67和PCNA的mRNA表达下调(P<0.05),CYCLIND1和PCNA的蛋白表达也下调(图2A,B)。

上述结果表明,和厚朴酚可以抑制hADSCs增殖,并且这种抑制效果具有浓度依赖性。

2.2 和厚朴酚促进hADSCs凋亡

采用不同浓度的和厚朴酚(0、10、20和50 μmol/L)处理hADSCs 48 h后,annexin V/PI检测细胞凋亡。随着和厚朴酚浓度增加,hADSCs的凋亡率逐渐上升(P<0.01) (图3A,B)。

The effect of honokiol of different concentrations on apoptosis of hADSCs; A.cell apoptosis was detected by flow cytometry; B.statistical analysis of apoptosis rate; **P<0.01,***P<0.001 compared with 0 μmol/L group.

进一步的RT-qPCR和Western blot检测结果显示,随着和厚朴酚浓度增加,促凋亡基因BAX和TP53的mRNA表达上调(P<0.01),抗凋亡基因BCL2的mRNA表达下调(P<0.05)。促凋亡基因BAX蛋白表达上调,抗凋亡基因BCL2蛋白表达下调(图4A,B)。

The effect of honokiol at different concentrations on gene expression related to apoptosis of hADSCs; A.RT-qPCR detected the mRNA expression of BAX, BCL2 and TP53; B.Western blot detected the protein expression of BAX and BCL2; *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 μmol/L group.

上述结果表明,和厚朴酚可以促进hADSCs凋亡,并且这种促进作用具有浓度依赖性。

2.3 和厚朴酚抑制MEK-ERK1/2信号通路活化

文献报道,和厚朴酚可调节MAPK/ERK信号通路抑制乳腺癌SK-BR-3细胞增殖、迁移和侵袭[6]。本研究进一步采用Western blot方法检测不同浓度的和厚朴酚处理后对hADSCs的MAPK/ERK信号通路活性的影响。与空白对照组相比,10、20和50 μmol/L和厚朴酚浓度组hADSCs中p-MEK和p-ERK1/2蛋白的表达明显下调,而总的MEK和ERK1/2蛋白的表达并未发生明显变化(图5)。

图5 和厚朴酚抑制MEK-ERK1/2信号通路活化Fig 5 Honokiol inhibited the activation of MEK-ERK1/2 signaling pathway

3 讨论

肿瘤微环境是一个高度复杂的系统,主要由肿瘤细胞、浸润性免疫细胞、癌相关基质细胞(如MSCs)和脂肪细胞,以及细胞外基质和多种信号分子组成[2]。MSCs被肿瘤细胞在癌变过程中分泌的可溶性因子募集到肿瘤组织中,通过直接与肿瘤细胞接触、旁分泌甚至与肿瘤细胞融合的方式促进肿瘤的发生发展[7]。因此,抑制肿瘤微环境中的MSCs生长也是抗癌治疗的靶点。

和厚朴酚在体内外环境中都表现出对不同癌症的化学预防和治疗潜力。研究表明和厚朴酚作用于肿瘤细胞的多种生物学功能(增殖、凋亡、转移和耐药)发挥抗癌效应[8-9]。本研究着重讨论和厚朴酚对肿瘤微环境中hADSCs的调节作用。研究发现使用0、10、20和50 μmol/L和厚朴酚作用于hADSCs,细胞增殖和细胞凋亡相关实验检测结果表明和厚朴酚通过抑制hADSCs增殖,同时诱导凋亡,从而有效抑制hADSCs的生长。和厚朴酚作用48 h抑制多数肿瘤细胞增殖的IC50在15～50 μmol/L之间[6, 9-10],表明上述浓度的和厚朴酚用于抗肿瘤治疗时,可同时抑制肿瘤微环境中的MSCs生长,进一步发挥其抗癌效应。然而,MSCs广泛分布于结缔组织和器官间质中。提示和厚朴酚应用于抗肿瘤治疗时,药物随血液到达全身可能对正常组织产生影响,表现出组织损伤不易修复等副作用。

ERK信号通路能响应各种细胞外刺激,包括生长因子、细胞因子以及直接的细胞外应激。已有文献报道,和厚朴酚能下调p-ERK1/2表达水平抑制乳腺癌SK-BR-3 细胞增殖,促进凋亡[6]。因此,本研究中检测了不同浓度和厚朴酚处理hADSCs后p-MEK和p-ERK1/2表达水平,结果证实和厚朴酚呈浓度依赖性抑制MEK/ERK1/2 信号通路。

总之,和厚朴酚可能通过干扰MEK/ERK1/2 信号通路激活抑制hADSCs增殖,诱导凋亡,从而有效抑制hADSCs生长,减弱其对肿瘤发生发展的支持作用。这一发现提示和厚朴酚应用于抗癌治疗的过程中,肿瘤微环境的改善也是其治疗靶点。