清热化湿调枢方对葡聚糖硫酸钠结肠炎模型小鼠肠黏膜MUC-2、Claudin-2表达的影响

王倩影 杨晨 钟卓泰 张涛 姚梦茜 王琳 张格知 班彦然 苏晓兰 魏玮

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)以非特异性肠道炎症为病变特点[1],主要表现为腹泻、黏液脓血便和腹痛,病变范围主要局限于结肠及直肠黏膜,是一种难治性、易复发的消化系统疾病。

UC是肠道肿瘤发生的重要危险因素之一[2],有报道称,UC患者的结直肠癌风险比普通人高3～5倍[3],而且病程越长,癌变机率越高[4]。尽管治疗UC的药物日新月异,包括用于诱导和维持UC缓解的5-氨基水杨酸(5-amino salicylic acid,5-ASA)药物、皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂等,但无法维持这种疾病的缓解和避免复发,在临床上仍是一个难以解决的问题。保护肠道免受有害物质入侵的第一道屏障——肠黏膜屏障,当肠道上皮细胞受到破坏,黏液层的组成出现缺陷时,就会导致肠道屏障的破坏,从而促使肠道炎症产生[5]。因此,维护肠道黏膜屏障功能完整,提高黏膜修复能力是预防和维持UC患者病情稳定的重要环节。

中医药治疗UC强调的是系统化的认识和个体化的治疗,且中药具有多成分,多环节,多靶点优势,能够起到诱导缓解、预防病情复发、延长复发时间、稳定患者病情的作用。清热化湿调枢方为魏玮教授传承国医大师路志正先生学术思想的基础上,根据三十余年临床经验及对UC病因病机的认识,化裁乌梅丸、葛根芩连汤等经典名方而来,方中以乌梅、败酱草、白芍、白术、太子参、茯苓、木香、黄连、秦皮等药为主,功专清热化湿,健脾调枢,临床研究显示清热化湿调枢方治疗溃疡性结肠炎临床疗效突出[6]。前期课题组的动物实验表明,清热化湿调枢方对DSS结肠炎小鼠的肠道黏膜屏障损伤有修复作用,但尚不清楚清热化湿调枢方在预防和延缓UC发作方面,能否保持肠道屏障功能稳定。本研究将基于肠道黏膜组织中粘蛋白2(mucoprotein-2,MUC-2)、闭合蛋白2(Claudin-2)表达变化,通过建立葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导的UC小鼠模型,探讨清热化湿调枢方在预防和缓解DSS结肠炎模型小鼠肠黏膜屏障功能损伤方面可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

购买于北京斯贝福生物技术有限公司的SPF级C57BL/6小鼠24只,雄性,8周龄,体质量(20±2)g,实验动物许可证号:SCXK(京)2015-0015。在中国中医科学院针灸所SPF级兽舍饲养实验鼠,在室温(24±2)℃、相对湿度35%～45%的通风隔音笼舍内,每隔12小时进行一次光照与黑暗交替饲养。本实验已由中国中医科学院针灸研究所伦理委员会审批,实验伦理证号:D2021-03-16-2。

1.2 药物与试剂

中药免煎颗粒:购于四川新绿药业,用蒸馏水配至所需浓度得到中药混悬液,于4 ℃保存备用,使用前恢复室温并摇匀。清热化湿调枢方(乌梅12 g、败酱草12 g、黄连6 g、当归10 g、炒白芍12 g、木香9 g、枳实10 g、葛根12 g、麸炒白术10 g、太子参12 g、茯苓15 g、秦皮12 g、儿茶6 g、甘草9 g)1剂生药转换为免煎颗粒为13 g。

美沙拉嗪混悬液:美沙拉嗪肠溶片(0.5 g/片,LosanPharmma GmbH公司,进口药品注册证号:H20171358),外部黄色药衣于每日干预前刮去,取0.5 g药片,充分溶于50 mL温水制成使用。

DSS溶液:美国MP Biomedicals公司(43 kDa,批号160110),用100 mL纯水溶解2.5 g的DSS配成2.5%的DSS溶液。

MUC-2单抗(货号:PAA705Mu01)、抗原修复液(货号:C1010)、PBS缓冲液(货号:C1003)、苏木精染液(货号:C1001)、二抗(货号:PAE001)、DAB显色剂(货号:C1101),48T(货号:SEA641Mu),购于武汉云克隆科技股份有限公司;抗闭合蛋白2(Claudin-2)抗体(货号:ab15098),购于Abcam公司;水合氯醛(批号:EB05980),购于上海士锋生物科技有限公司;中性组织固定液(批号:R20486) 购于上海源叶生物科技有限公司;苏木素—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色液(批号: H8070) ,购于北京赛因坦科技有限公司;BSA(货号:A8020),购于Solarbio公司。

1.3 仪器

电泳仪(型号:DYY-6D)、电泳槽(型号:DYCZ-24DN),北京六一仪器厂;其林贝尔水平摇床(型号:TS-1),海门市其林贝尔仪器制造有限公司;转印槽(型号:JY-ZY5),北京君意东方电泳设备有限公司;X胶片观片灯(型号:GPD-Ⅱ),北京雅迪莱特医疗科技有限公司;扫描仪(型号:5600F),佳能公司;高速冷冻离心机(型号:HC-3018R),安徽中科中佳科学仪器有限公司;超声细胞破碎机(型号:650Y),上海利闻科学仪器有限公司;紫外分光光度计(型号:UV1800),日本岛津公司;脱水机(型号:JJ-12J),武汉俊杰电子有限公司;包埋机(型号:KD-BM)、病理切片机(型号:KD-2258)、冻台(型号:KD-BL)、组织摊片机(型号:KD-P),浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;正置光学显微镜(型号:CK31),日本奥林巴斯公司。

1.4 分组

24只小鼠进行为期1周的适应性饲养,采用随机函数进行分组,分为正常组、模型组、清热化湿调枢方组、美沙拉嗪组,每组6只。

1.5 干预与造模

参照《中药药理研究方法学》[7],按小鼠与人体表面积比等有效剂量折算的比例,作为给药剂量,将人的日常给药剂量折算为小鼠等有效剂量。在UC模型小鼠造模过程中,同时进行药物干预。正常组可自由饮用蒸馏水,其余各组小鼠参照Wirtz等造模方法,给予2.5%的DSS水溶液自由饮用7天。自造模第1天起,每日1次,连续7天,清热化湿调枢方组小鼠予清热化湿调枢方灌胃,剂量为1.69 g/(kg·d),美沙拉嗪组给予美沙拉嗪混悬液灌胃,剂量为0.52 g/(kg·d),正常组和模型组给予0.5 mL纯水灌胃,至第8天安乐死小鼠取结肠组织。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 一般情况 每天对各组小鼠的精神状态、皮毛色泽、大便性状、肉眼血便及大便潜血、体质量等一般情况的变化进行观察并记录。

1.6.2 疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分[8]根据Murano M等[9]的研究,评估小鼠体质量下降、大便性状以及潜血情况,并计算出各组小鼠DAI评分,对疾病活动情况进行评估。DAI评分=(体质量下降分数+大便性状分数+潜血分数)/3。

1.6.3 测量结肠长度及观察结肠切片组织学变化 干预结束后,用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉小鼠并将其处死,分离结肠后测量结肠长度,在结肠远端约1 cm处取病理组织,用10%中性甲醛固定,石蜡包埋,切片,病理染色。在光镜下观察小鼠结肠切片组织学变化。

1.6.4 用蛋白印迹法检测结肠组织MUC-2、Claudin-2蛋白表达水平 将结肠组织剪碎,取蛋白样品测定浓度。加适量浓缩SDS-PAGE蛋白上清缓冲液,通过电泳及转膜。完成转膜后,室温封闭PVDF膜1小时,用PBST进行冲洗。将一抗稀释至1∶500,一抗孵育,在室温水平摇床上缓慢摇动1小时,PBST冲洗3次;二抗孵育方法重复上述操作。利用化学发光检测系统,在化学发光底物中加入PVDF膜,然后放进增光屏的暗盒中进行曝光,扫描图片显影、定影。以GAPDH单抗检测作为内参对照,利用ImageJ V1.8.0.112对目标蛋白条带的灰度值加以分析。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况比较

正常组小鼠状态良好、毛色黑亮,进食和饮水均正常。模型组在第3～5天,部分小鼠粪便潜血阳性,造模结束时,该组大部分小鼠见肉眼血便,出现腹泻,可明显观察到活动迟缓,精神萎靡,喜蜷缩,小部分无肉眼血便小鼠同样显示粪便潜血阳性。与模型组比较,美沙拉嗪组及清热化湿调枢方组小鼠精神状态良好,毛发色泽黑亮,活动未见明显迟缓,大便稀软及便血情况较少。

2.2 各组小鼠体质量、DAI评分及结肠长度比较

与正常组相比,模型组、美沙拉嗪组和清热化湿调枢方组小鼠的体质量显著降低(P<0.05)。美沙拉嗪组和清热化湿调枢方组组间比较差异无统计学意义(P>0.05),但与模型组比较,两组小鼠均显示体质量增加, DAI评分下降, 结肠长度增长(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠体质量、DAI评分及结肠长度比较

2.3 各组小鼠结肠病理情况比较

图1示,正常组小鼠肠黏膜上皮完整,杯状细胞数量较多,固有层排列整齐,具有完整的隐窝结构,无炎细胞浸润。模型组小鼠肠黏膜上皮缺损,杯状细胞明显减少,固有层和隐窝结构破坏严重,见大量炎细胞浸润。美沙拉嗪组小鼠结肠黏膜上皮可见多处黏膜中断,固有层排列欠规整,部分隐窝结构破坏,杯状细胞减少,少量炎细胞浸润。清热化湿调枢方组小鼠结肠组织中黏膜上皮基本完整,杯状细胞较多,隐窝结构完整且规律排列,无炎细胞浸润。

注:A 正常组;B 模型组;C 美沙拉嗪组;D 清热化湿调枢方组。

2.4 各组小鼠蛋白表达水平比较

模型组小鼠MUC-2蛋白表达与正常组比较明显降低(P<0.05);美沙拉嗪组和清热化湿调枢方组小鼠MUC-2蛋白表达与模型组比较明显升高(P<0.05)。模型组小鼠Claudin-2蛋白表达与正常组比较明显降低(P<0.05);清热化湿调枢方组小鼠Claudin-2蛋白表达与模型组比较明显升高(P<0.05),美沙拉嗪组小鼠Claudin-2蛋白表达虽有增加趋势,但与模型组比较差异无统计学意义,见表2。各组小鼠结肠组织MUC-2、Claudin-2蛋白电泳图见图2。

注:A 正常组;B 模型组;C 美沙拉嗪组;D 清热化湿调枢方组。

表2 各组小鼠结肠组织MUC-2、Claudin-2蛋白相对表达比较鼠只=6)

3 讨论

根据腹痛、腹泻、下利赤白脓血等临床表现,溃疡性结肠炎可归属于中医学“肠澼”“泄泻”“下利”“休息痢”等范畴。病位在大肠,久病易损肝肾,其根本责之于脾虚。本病主要病机在于脾虚引起的内湿不运,郁久化热,湿热相搏,下注大肠,气血搏结,肠道血络脂膜受损,血败肉腐而成疡。大肠湿热胶着不化,气血津液运行受阻,因浊成痰,搏血成瘀,致大肠传导失司,脾胃升降失调,中焦枢机逆乱而出现腹痛、腹泻、下利赤白、里急后重等症状。治疗当紧扣脾虚湿热蕴肠,脾胃枢机失衡的核心病机,以清肠化湿、健脾调枢为主。

清热化湿调枢方重用乌梅,取其酸涩止泻之用,《本草求真》言乌梅“收涩之性,而使下脱上逆皆治”,败酱草清热解毒、消痈排脓,白芍苦酸入肝,养肝阴而柔刚木桀骜之威,故能养血柔肝,木达则土和,故能缓急止痛,白术、太子参、茯苓、炙甘草四味取四君子之意,健脾益气,使脾健而行,非专止泻而泻自能止,又久泻耗气伤津,故取太子参易人参以健脾益气。木香配黄连、秦皮善治湿热泻痢,伍枳实调气而除痞胀,当归养血和血,儿茶苦涩收敛,葛根升发清阳,调畅脾胃枢机,鼓舞脾胃阳气上升而泻止,取“清气在下,则生飧泄”之意。甘草和中缓急,调和诸药。上药合用共奏清热化湿,健脾调枢之功。现代药理学研究表明,乌梅具有抗炎、抗菌等作用[10-11],其机制可能与影响细胞通透性有关。败酱草提取物可下调促炎因子而发挥抗炎功效[12]。

实验结果表明,经美沙拉嗪和清热化湿调枢方干预后的小鼠与模型组相比,如软便、便血等一般情况均有明显改善,疾病活动指数得分下降,组织病理、黏膜结构损害不明显。以上结果显示,清热化湿调枢方在预防和稳定DSS结肠炎小鼠的肠组织病理损伤方面效果突出,与美沙拉嗪近乎等效。

在UC的发生和发展中,肠道屏障功能起着不容忽视的作用,UC肠道黏膜屏障损伤或早于炎症表现在多项研究中体现[13-14]。肠黏膜屏障是肠道重要的“防线”,它可以阻止病原体、细菌、毒素等与上皮直接接触,进入体循环[15]。黏蛋白是黏液的主要成分,其屏障和润滑功能在维持肠道稳态方面起着至关重要的作用[16-17]。MUC-2是结肠黏液屏障中最主要的黏蛋白,在结肠黏膜杯状细胞的细胞质中表达,MUC-2的高度糖基化保护蛋白免遭降解,并促进与水的相互作用,有利于形成黏液凝胶,使细菌与上皮分离,保护肠道正常结构功能,使机体能够有效抵御细菌及毒素的侵害[18],并能在一定程度上修复机械损伤,从而起到保护结肠黏膜的作用[19]。因此MUC-2的含量可以作为衡量结肠黏膜完整性及修复程度的重要生物学指标。主要由上皮紧密连接中跨膜蛋白和胞质支架蛋白组成的肠道黏膜机械屏障是肠道屏障中最重要的组成部分。Claudin蛋白是构成紧密连接复合体的主要结构,不同的Claudin分子对紧密连接的通透性有不同的影响。一部分Claudin分子被称为“leaking”Claudin,它们可以形成特异性离子通道,从而提高上皮和内皮通透性,其中就包括Claudin-2[20-21]。Claudin-2与孔隙形成有关,表达上调可能会增加细胞旁通透性,影响紧密连接的结构和功能,导致黏膜屏障结构功能紊乱[22]。

经本次实验发现,与模型组比较,DSS结肠炎小鼠的结肠组织中Claudin-2、MUC-2的表达,在美沙拉嗪和清热化湿调枢方干预后,表现出较高的恢复程度,这表明清热化湿调枢方对黏蛋白的恢复以及肠黏膜屏障的修复有显著的作用,并且其疗效与美沙拉嗪近似。

综上,清热化湿调枢方可以有效预防DSS结肠炎小鼠肠黏膜损伤,其作用机制可能与促进结肠组织中黏蛋白MUC-2、Claudin-2的分泌,使黏膜愈合,从而维护黏膜屏障完整性有关。本实验存在以下不足,如未对肠道免疫屏障、肠道菌群等方面进行研究,而仅从肠黏膜机械与化学屏障的相关蛋白探索了部分机制,后续应进一步拓展研究范围,为清热化湿调枢方预防UC复发提供更可靠的实验证据。