基于网络药理学和分子对接技术探讨血府逐瘀汤“异病同治”治疗冠心病和缺血性脑卒中的作用机制

匡慧芳 李静 郭志华 刘祎 王明韵 张秋雁

心脑血管疾病为中国城乡居民的首要死亡原因,其患病率和死亡率仍居高不下[1]。研究表明冠心病(coronary heart disease,CHD)发展程度与缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)有密切关系,二者相互促进病情发展,给临床用药造成了困扰。且患病后遗留不同程度的功能障碍,影响患者的生活质量[2]。CHD和IS具有相似的致病因素,均与血压水平、吸烟等常见危险因素有关,古代医家认为二者发病与外邪、痰饮、气血亏虚、阳气不足而致病理因素瘀滞血脉关系密切[3]。

血府逐瘀汤是活血化瘀经典名方,出自清代王清任《医林改错》,由桃仁、红花、当归、川芎、枳壳、柴胡等11味中药组成,临床上用于治疗心脑血管等疾病,疗效确切[4-7]。越来越多的证据支持神经系统与心血管系统的生理、病理之间存在密切联系,称之为脑—心轴。现代研究显示脑卒中所致心脏损伤(stroke induced heart injury,SIHI)其病理生理机制分为全身系统性和心脏局部性[8-10],同时二者在多个病理变化上十分相似,如动脉粥样硬化的形成、血流动力学异常和炎症反应等过程。而血府逐瘀汤在保护血管内皮、改善血液流变学特征、抗炎和抗氧化应激等方面疗效确切[11]。

基于中药成分数据库、潜在靶标预测技术、网络分析平台的网络药理学研究方法与中药及其复方所发挥的药效作用相符,有助于血府逐瘀汤“异病同治”治疗CHD和IS的科学内涵和分子机制的阐释[12]。本研究探索血府逐瘀汤治疗CHD和IS的活性成分、作用靶点及其参与的生物过程和信号通路,进而构建关联网络,为阐释血府逐瘀汤“异病同治”效果的科学内涵和效应机制提供了新思路和新方法,为血府逐瘀汤的临床新应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 血府逐瘀汤药物活性成分筛选与靶点获取

在TCMSP数据库(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中检索本方药物组成,筛选血府逐瘀汤各药物的活性成分(OB≥30%,DL≥0.18为条件)[13-14],基于上述候选成分获取相应靶标。此外,对于未收录的中药结合相关文献[15],对其中有明确生物活性及药理作用的成分予以纳入。经Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)校正靶标名称。

1.2 疾病靶点的获取

以“Coronary heart disease”和“Ischemic stroke”为关键词分别在OMIM(https://omim.org)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)、TTD(http://metascape.org/gp)和DrugBank(https://go.drugbank.com)数据库中获取CHD和IS的疾病相关靶点。汇总并去重以上数据库疾病靶点,即为治疗CHD和IS两种疾病的潜在靶点。通过靶点可构建疾病与活性成分关联进而建立与各药材的关系。

1.3 复方网络图及PPI网络构建及分析

在Cytoscape 3.7.1软件中上传血府逐瘀汤的中药、有效成分及相应靶点,构建“中药—成分—靶点”复方网络图。将有效成分相应靶点与疾病靶点的交集靶点导入STRING11.5数据库(https://cn.string-db.org/),限定物种为“homo sapiens”,蛋白间相互作用(protein-protein interaction,PPI)≥0.4,下载PPI数据,可得到关键靶点信息,并通过Cytoscape 3.7.1进行可视化。

1.4 基因本体功能和基因组通路富集分析

采用Metascape(http://metascape.org)基因富集分析库对“1.2”项交集靶点实现基因本体(Gene Ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。设置物种为“H.sapiens”,最小交叠值为3,P<0.01,GO分析分别采用生物过程(biological process,BP)、细胞组成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)结果的前10位,KEGG分析根据校正后P值大小对结果进行排序,结果通过微生信网站(www.bioinformatics.com.cn)绘制BP、CC、MF三合一柱状图和KEGG气泡图。

1.5 分子对接

分别通过Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取活性成分的2D结构的mol2格式文件及靶标3D结构的pdb格式文件,运用AutoDockTools-1.5.6软件进行分子对接,通过比较结合能的大小分析化合物和靶点间的亲和力,对接结果经Pymol软件可视化呈现。

2 结果

2.1 血府逐瘀汤“中药—成分—靶点”网络图

通过TCMSP数据库筛选并检索对应靶蛋白,去除重复的活性成分后共获得189种,包括桃仁23种、红花22种、当归2种、牛膝4种、川芎7种、桔梗7种、赤芍29种、枳壳5种、柴胡17种、甘草92种,共有成分有11种,并结合文献补充生地黄3个活性成分。通过Uniprot数据库查找对应靶蛋白名称,去除重复和无效靶点后得到394个靶点蛋白。将血府逐瘀汤的组分、有效成分和预测靶标导入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化展示,构建“中药—成分—靶点”网络图,该网络包括556节点,2533条边,见图1。

注:淡绿色代表血府逐瘀汤中各味中药;字母A1-J1代表两味及以上中药共有的化合物;深蓝色代表血府逐瘀汤的潜在靶点。

2.2 血府逐瘀汤治疗CHD和IS的共同靶点

检索OMIM、DrugBank、DisGNET、TTD、GeneCards数据库,获得CHD相关疾病靶点2719个、IS相关靶点2220个。将血府逐瘀汤中所预测的靶点和2种疾病的靶点分别输入在线网站Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),得到135个交集靶点(图2),导入Cytoscape 3.7.1构建血府逐瘀汤治疗CHD和IS的“单味药—共有靶点—疾病”网络(图3)。通过对网络进行拓扑分析,Degree值大小说明该成分在网络中的调控作用的强弱。将数据按Degree值降序排列并下载文件,结果表明,槲皮素、木犀草素、山柰酚等化合物可能是血府逐瘀汤治疗CHD和IS的核心成分,具体信息见表1。

表1 血府逐瘀汤治疗CHD和IS的成分中度值前10的活性化合物的相关信息

图2 血府逐瘀汤治疗CHD和IS的靶点交集韦恩图

注:绿色代表两种疾病;红色部分:TR 桃仁;HH 红花;DG 当归;DH 生地黄;NX 牛膝;CX 川芎;JG 桔梗;CS 赤芍;ZQ 枳壳;GC 甘草;CH 柴胡;蓝色部分:疾病和药物的相交靶点。

2.3 构建共有靶点PPI网络

利用STRING11.5构建PPI网络,见图4、5。该网络含135个节点,2971条边。节点代表靶点,连线代表它们的交互作用,颜色深浅代表靶点度值大小。根据表2中网络节点的度值、介数中心性和中心接近度参数综合筛选排名靠前的核心靶点,其中白蛋白(albumin,ALB)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、RAC-丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,Akt1)、胰岛素(insulin,INS)、白细胞介素-1β(interleukin-1,IL-1β)的度值最突出,提示以上靶点可能是血府逐瘀汤治疗CHD和IS的核心靶点。

图4 潜在靶点PPI网络图

图5 关键靶点PPI网络图

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

设置P<0.01,GO分析获得BP1851条、CC90条、MF148条。根据P值降序排列,分别选取排前10位条目见图6。血府逐瘀汤治疗CHD和IS所涉及的生物过程主要参与激素的反应、对营养水平的反应、炎症应答等;主要分布于膜筏、内质网腔囊泡腔、细胞外基质等部位;与RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、信号受体调节剂的活性、蛋白酶结合等分子功能关联性较大。

注:A KEGG通路富集;B BP生物过程、CC细胞组分、MF分子功能。

KEGG分析共富集199条信号通路(P<0.01),选取P值前20位通路见图6。排除与本研究不相关通路(如癌症通路、前列腺癌、阿米巴病等),血府逐瘀治疗CHD和IS主要作用于脂质和动脉粥样硬化、低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)、松弛素、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路等。

2.5 分子对接结果

将从血府逐瘀汤中筛选出的7个质量标志物与5个靶点蛋白进行分子对接,ALB、IL6、TNF、Akt1、INS作为受体,槲皮素、木犀草素、山柰酚、异鼠李素、柚皮素、川陈皮素、7-methoxy-2-methyl-3-phenylchromen-4-one作为配体,分子对接结果见表3、图7。结合性较好的前五个分子对接结果见图8。结合能<0,表明受体与配体能自发结合;结合能越小表明二者结合性越好,结合能<-5.0 kcal/mol,表明其结合良好[16]。

表3 活性成分—核心靶点对接结果结合能

注:横轴为药物核心成分,纵轴为预测核心靶点。颜色从蓝到红,表示结合能的数值大小由高到低。

图8 血府逐瘀汤主要成分与核心靶点的分子对接图

3 讨论

血府逐瘀汤是临床活血化瘀经典名方,现代临床研究表明,该方可治疗多种神经精神疾病和心血管疾病如血管性头痛、脑梗死后轻度认知障碍、CHD、慢性心力衰竭等。脑卒中属于中医“中风”范畴,而“瘀”尤在缺血性中风病的发生发展中发挥关键作用[17]。血瘀是多种疾病发展过程的关键环节,王清任提出“治病之要诀,在明白气血”,血府逐瘀汤重在调和气血,体现其临床重要价值。中医对于“心与脑”的认识,如《医学衷中参西录》记载“人之神明,原在心与脑两处,神明之功用,原心与脑相辅相成”“神明之体藏于脑,神明之用发于心”,体现“心脑相通”,这与现代医学中“心脑轴”观念不谋而合。心脑血管疾病在多个病理变化上近似,如动脉粥样硬化的形成、血流动力学异常和炎症反应等过程。基于以上理论,本团队推测血府逐瘀汤能够阐释中医理论“异病同治”的科学内涵发挥对CHD和IS具有一定的治疗作用。同时也运用网络药理学和分子对接技术验证中药复方治疗疾病多靶点特色。

本研究发现血府逐瘀汤的不同药味存在相同的活性成分,不同成分又存在与同一靶点产生联系,充分展示了中药复方具有整体观念,具有“多成分、多靶点、多途径和多效应”的优势,体现了在中医“异病同治”理论的指导下,可以提高疗效的同时减少患者的用药频次。本研究中血府逐瘀汤共有192种活性成分,发现Degree值较高的核心成分中,槲皮素是黄酮类化合物中具有强大的清除活性氧簇的能力,可以通过血脑屏障,其心血管保护作用与抗氧化功能密切相关。在炎症早期,槲皮素不仅能下调中性粒细胞IL-6的表达,调控NF-κB信号通路抑制凋亡和乙酰胆碱酯酶,减轻新生大鼠缺氧缺血性脑损伤和顺铂对H9C2细胞的细胞毒作用,还能诱导神经保护发挥保护血管内皮功能的作用和抗炎作用[18-21]。木犀草素是一种天然多酚,在抗炎、抗氧化、抗癌、细胞保护和巨噬细胞极化等方面具有生物活性。对IS模型大鼠的研究发现木犀草素不仅能通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,还能抑制HIF-1α/NLRP3信号通路,从减轻神经细胞凋亡、炎症和氧化应激程度等方面减轻认知障碍[22-23]。山柰酚不仅能调控NF-κB经典促炎信号通路促进抗凋亡蛋白的表达,抑制缺血性脑神经元死亡和神经胶质细胞活化,降低大鼠外周血和大脑中中性粒细胞的激活和数量,还能正常化卵巢切除术+高脂饮食诱导的载脂蛋白E(APOE)-/-模型小鼠的血管形态和脂质水平,并显著抑制氧化应激、炎症和凋亡水平,从而减轻动脉粥样硬化[24-25]。CHD和IS的发病与动脉粥样硬化有关,其发生发展伴随着脂质堆积、血管内皮损伤、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等病理过程[26-27],通过研究该方主要活性成分的现代药理作用,可知血府逐瘀汤可以通过炎症因子的释放、调节细胞凋亡、减轻氧化应激、保护血管内皮功能、降低脂质水平等方式,从而实现相应的治疗作用,与CHD和IS的发病机制相符。

分析核心靶点和血府逐瘀汤主要活性成分的对接结果,在所有的关键靶点蛋白中,Akt1与潜在活性成分7-methoxy-2-methyl-3-phenylchromen-4-one之间的结合能力最强,其结合能为-6.88 kcal/mol。分子虚拟对接的结果表明血府逐瘀汤潜在活性成分与关键靶点之间的结合性均较好,可以通过相互作用而发挥血府逐瘀汤异病同治CHD和IS的功效。推测本方活性成分可能通过调控炎症应答、细胞对脂质的反应、对氧水平的反应、对细胞群增殖的负调控作用等过程抑制细胞炎症、调节脂质水平、抑制细胞凋亡。通过构建PPI网络图可知血府逐瘀汤治疗CHD和IS主要作用于ALB、IL-6、TNF、Akt1、INS等靶点,提示为关键性靶蛋白,它们大多与炎症因子相关,与二者的共同病理过程中炎症因子释放相吻合。ALB作为本方Degree值最高的潜在靶点在许多生物过程中起着重要作用。ALB属于脂代谢途径相关的蛋白质与改善血液流变性有关,研究发现低蛋白血症、炎症及内皮损伤和动脉粥样硬化性疾病密切相关,并观察包括ALB在内的蛋白质的特异性变化,能提高对不同类型动脉粥样硬化患者的诊断准确性[28-30]。对一项多中心、随机、盲法对照的临床研究发现IS发病5小时内给予患者静脉注射25%人白蛋白(ALB)2 g/kg,存在良好地改善临床疗效的趋势[31]。KEGG通路富集发现血府逐瘀汤异病同治CHD和IS相关通路有脂质和动脉粥样硬化、HIF-1、松弛素、NF-κB和胰岛素抵抗等信号通路。脂质和动脉粥样硬化是二者共同的病理基础,在此不作赘述。HIF-1是一种敏感的氧稳态调节因子,在缺氧/缺血情况下会迅速表达。HIF-1信号通路与冠状动脉易损斑块的不稳定性有关,具有保护缺血缺氧的心肌细胞、抗氧化应激损伤、调节细胞凋亡、线粒体功能和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达影响血管新生的作用;还能调节神经炎症、血管生成、糖代谢和血脑屏障干预脑卒中的病理变化[32-33]。松弛素信号通路在心脑血管疾病的生理病理起着关键作用,研究证明松弛素促进血管舒张及血管生成,改善缺血/再灌注引起的心脏损伤心脏肥大和并逆转心肌梗死后的纤维化[34-36];临床研究表明脑缺血后6小时给予人类基因-2(H2)-松弛素具有抗炎和抗细胞凋亡作用[37]。当机体发生胰岛素抵抗时,游离脂肪酸水平升高促进活性氧簇升高引起氧化应激和内质网应激,进而刺激脂肪组织合成和分泌大量促炎细胞因子、急性期反应物、血管紧张素Ⅱ等生物活性物质;脂肪组织会激活典型的促炎性NF-κB通路[38-39]。发生脑缺血再灌注时,NF-κB信号通路被激活并释放大量TNF-α等炎性因子造成脑神经元损伤和神经炎症反应,经中药干预能减轻病灶炎症发挥对脑组织的保护作用[40-41]。以上机制都有助于内皮功能障碍、动脉粥样硬化和血栓形成,参与心脑血管疾病的形成。

综上所述,本研究通过网络药理学结合分子对接技术,探索血府逐瘀汤“异病同治”治疗CHD和IS多途径、多成分、多靶点发挥药效的特点。证实了血府逐瘀汤活性物质与CHD和IS的核心治疗靶点具有较强的结合力,其中槲皮素、木犀草素、山柰酚等为主要活性成分,通过ALB、IL-6、TNF、Akt1、INS等关键靶点,干预脂质和动脉粥样硬化、HIF-1、松弛素、NF-κB和胰岛素抵抗信号通路等关键生物过程,实现对机体的炎症反应、氧化应激及血管新生和血管功能障碍、细胞的凋亡和脂质代谢等产生影响,调节细胞炎症反应的进展,改善局部血液流变学,以实现对CHD和IS治疗效果。结合上面的分析结果,下一步可围绕血府逐瘀汤对于HIF-1、松弛素、NF-κB及胰岛素抵抗等信号通路的作用及本方对脂质代谢和胰岛素抵抗等病理机制展开进一步研究。本研究为血府逐瘀汤的新的临床应用提供理论依据,在治疗CHD和IS的新药研制方面提供新思路和新方法。但本研究的结果和结论受到数据库信息不全、疾病靶点尚未得到彻底研究等方面的限制,筛选和预测的结果均存在一定的偏倚,仍需要通过进一步的临床和实验研究加以验证。