焦亡相关基因在膀胱癌中的作用鉴定与预后分析研究

徐 鑫，矫宾宾，李晓琦，方自林，张 冠

（1.中日友好医院 泌尿外科，北京 100029；2首都医科大学附属朝阳医院 泌尿外科，北京 100020）

膀胱癌是一种起源于尿路上皮的常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率均较高，严重威胁了人们的健康。细胞焦亡，也被称为细胞炎性坏死，是一种新形式的程序性细胞死亡形式[1]，焦亡被认为是对抗感染的重要机制，它在肿瘤的发展中起着重要作用[2]。炎性囊泡、气皮蛋白和促炎细胞因子是焦亡的重要组成部分，在肿瘤发生、侵袭和转移过程中起着重要作用[3～5]。因此，焦亡可能是肿瘤发展的潜在生物标志物或基因标记，也可能对发现膀胱癌的预后相关基因标记具有重要意义。焦亡与肿瘤进展之间的关系是复杂的。一方面，焦亡抑制肿瘤的发生和发展；另一方面，焦亡也会形成一种可以将营养物质运送到癌细胞并促进其生长的微环境[6]。由于焦亡对肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移有显著影响，因此影响肿瘤的预后[6]。当焦亡发生时，一系列信号分子和细胞因子被激活和释放，同时强烈的炎症反应和免疫系统反应被激活[7]，焦亡的强促炎作用与肿瘤免疫微环境的调节有关，但具体过程尚不清楚。已有研究表明，焦亡在肿瘤的发生和抗肿瘤过程中起着重要作用；然而，焦亡相关基因（pyroptosis-related genes，PRGs）在膀胱癌中的价值尚未被阐明，因此，我们研究了PRGs 的表达谱及其与预后相关的意义，以及相关的调控轴，并探讨膀胱癌中焦亡与肿瘤免疫微环境的相关性。

1 资料与方法

1.1 数据收集

通过CSC 癌症浏览器下载癌症基因组图谱（TCGA）数据库，其中包含406 个膀胱癌样本数据、437 份膀胱癌样本的miRNA 测序数据和410份临床资料。本研究的所有过程均遵循TCGA 数据库的相关指导方针和政策。

1.2 焦亡相关基因（PRGs）的获取

我们从此前的综述[6，8～10]中共获得33 个PRGs（表1），使用“limma”和“reshape2”软件包检测膀胱癌与正常组织之间的PRGs表达差异。

表1 33个细胞焦亡相关基因名称（PRGs）

1.3 功能富集分析

应用R 软件中的cluster-Profiler 软件包进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）2 种途径分析。获得了GO 通路（生物过程、分子功能和细胞成分）和KEGG通路。

1.4 预后相关分析及统计学方法

在单变量Cox 回归分析的基础上，通过LASSO Cox 回归分析建立预后基因模型，使用R 软件中的“glmnet”软件包和LASSO Cox 回归进行相关基因的选择和删除。

为了评估PRGs的预后价值，我们进一步采用多因素cox 回归分析来评估PRGs 与生存率之间的相关性，最后保留6 个基因及其系数，根据最小准则确定惩罚参数λ。根据中位风险评分将TCGA 数据库中406 例膀胱癌患者分为低危亚组和高危亚组，通过Kaplan-Meier 分析比较2 组的总生存时间（OS）。采用R 软件中的“survival”“survminer”和“timeROC”软件包生成1、3、5 年生存率的受试者特征曲线（ROC），每个变量的P值、风险比（HR）和95%置信区间（CI）显示在基于“forestplot”软件包的森林图中。

采用网络工具TIMER 来分析预后PRGs 与免疫浸润的相关性，包括目标PRGs表达、目标PRGs表达与大量免疫细胞（B 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞和单核细胞）浸润的相关性，以及基因表达与肿瘤纯度的关系。

我们构建了竞争性内源性RNA（ceRNA）网络，以阐明PRGs在膀胱癌中的潜在功能。ceRNA网络由starBase、TargetScan、miRDB、miRWalk 和RNA22 构建而成，用于预测与PRGs 结合的miRNA 靶点，用StarBase 预测与miRNA 相互作用的lncRNA靶点。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织和正常组织中DEGs的鉴别

在TCGA 数据库中比较19 个正常组织和406个肿瘤组织的差异表达基因（DEGs），这些DEGs与33 个PRGs 的交集包括IL6、PYCARD、CASP6和AIM2 基因，其中1 个基因（IL6）在肿瘤组织中下调，其余3 个基因（CASP6、AIM2、PYCARD）在肿瘤组织中上调。

2.2 功能富集分析

为了明确PRGs 的功能，我们使用GO 和KEGG 数据库进行分析。GO 分析表明，这33 种PRGs主要涉及参与凋亡过程的细胞因子的产生、炎性小体复合物和半胱氨酸型内肽酶的活性（图1A、1B、1C，见封二）；KEGG 分析表明，33 个PRGs主要参与了NOD 样受体信号通路（图1D，见封二）。而33 个PRGs 在肿瘤和非肿瘤样本之间的详细表达模式如图1E（见封二）所示。

图1 功能富集分析（圆点大小代表富集的基因数量）

2.3 预后相关基因模型的构建与分析

将上述33 个基因进行LASSO Cox 回归分析并构建预后模型，并对每个PRGs 与OS 进行单因素Cox回归分析，显示CASP8、CASP9、AIM2、GSDMB、CASP6 的高表达与良性预后相关（图2，见封二）。LASSO Cox 回归和多变量Cox 分析成功鉴定出6 个基因的特征，具体计算公式为：风险评分=（-0.318×CASP9 表达值+0.331×PRKACA 表达值-0.279×CASP6 表达值-0.186×TNF 表达值-0.110×AIM2 表达值-0.313×GSDMB 表达值）。根据风险评分公式计算的中位数评分，将406 例患者平均分为高风险组和低风险组，6 个基因的风险评分分布、生存状态及表达水平如图2A 所示。Kaplan-Meier 曲线显示，高风险评分的膀胱癌患者的OS概率低于低风险评分的患者，差异有统计学意义（P＜0.001，图2B），1年、3年和5年生存率的曲线下面积（AUC）分别为0.695、0.687和0.697（图2C）。同时，预测列线图显示与理想模型相比，1年、3 年和5 年OS 的预测性能尚可（图2D）。校准曲线图显示3年实际生存率与预测生存率一致（图2E），说明该列线图有一定的临床应用价值。

图2 预后基因模型分析

2.4 肿瘤免疫微环境分析

细胞焦亡在肿瘤免疫微环境的形成中起着至关重要的作用。多变量COX 分析和DEGs 中涉及的PRGs 的交集包括2 个PRGs，即AIM2 和CASP6，我们进一步使用TIMER 数据库来明确膀胱癌中预后相关PRGs（AIM2 和CASP6）与免疫浸润的相关性。数据显示AIM2 的表达与CD8+T 细胞（图3A，P=3.26e-6）和B 细胞（图3C，P=2.76e-4）的丰度呈正相关，而与巨噬细胞（图3D，P=1.68e-5）和单核细胞（图3E，P=2.57e-13）呈负相关。此外，CASP6 的表达与B 细胞（图3H，P=6.26e-4）和巨噬细胞（图3I，P=2.97e-3）的免疫浸润水平呈正相关。

图3 PRGs与免疫浸润的关系

2.5 mRNA-miRNA-lncRNA 网络的构建

为了阐明PRGs在膀胱癌中的分子机制，我们构建了mRNA-miRNA-lncRNA 相互作用的网络。RNA22、TargetScan、miRDB 和miRWalk 发现hsalet-7c-5p 是结合CASP6 的靶向mRNA。进一步分析显示，hsa-let-7c-5p 在膀胱癌中下调（图4A，P=1e-11），而低hsa-let-7c-5p 水平的膀胱癌患者有更好的OS（图4B，P＜0.001）。据此，我们研究了hsa-let-7c-5p 上游的lncRNA 靶点，构建了miRNA-lncRNA 轴，MIR29B2CHG lncRNA 被鉴定为靶点。同样，MIR29B2CHG lncRNA 在差异表达（P=0.026）和生存率（P=0.003）方面也存在统计学意义（图4C、4D）。ceRNA 网络调控轴如下所示：CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG。

图4 ceRNA网络中MiRNA及lncRNA的差异表达与生存率分析

3 讨论

细胞焦亡是一种新形式的程序性细胞死亡，在癌症的发展和治疗机制中发挥了双重作用[8]。一方面，正常细胞受到细胞焦亡释放的大量炎症因子刺激后，可以导致其转化为肿瘤细胞；另一方面，细胞焦亡的激活也可能促进肿瘤细胞的死亡，因此促进肿瘤细胞焦亡可能是一个新的治疗靶点。在本研究中，我们首先评估了33 种已知PRGs在膀胱癌中的表达水平和预后价值，与正常组织相比，膀胱癌组织中CASP6、PYCARD、AIM2表达升高，IL6 表达降低（|logFC|＞1，P＜0.05）。我们采用LASSO Cox 回归分析，基于6 种预后PRGs（CASP9、PRKACA、CASP6、TNF、AIM2、GSDMB）构建了一个预后基因模型，与理想模型相比，预测图显示1 年、3 年和5 年的OS 均预测较为准确，这表明焦亡相关基因可以用于膀胱癌生存期的预测，具有一定的临床意义。

在将DEGs 和相关基因纳入列线图之后，我们的分析显示AIM2 和CASP6 可以对预后产生较好的预测。AIM2 是一种细胞质的先天性免疫受体，可以识别在致病性攻击期间释放的双链DNA，能够导致多种多蛋白寡聚复合物的组装，而这些复合物被称为炎症小体[10，11]。AIM2 能够激活CASP-1，并通过ASC介导的紧密连接蛋白刺激IL-1β 和IL-18的成熟和释放，而这一过程也可能促进焦亡的发生[12]。然而AIM2 在各种癌症中的作用可能也不同，AIM2在结肠癌和肝癌中具有抑瘤功能，但在皮肤鳞癌中却具有促瘤功能[8，13]，AIM2基因具有微卫星不稳定位点，这导致了结直肠癌中频繁的基因突变[14，15]。此外，Patsos 等学者[16]发现AIM2 通过诱导细胞周期（G2/M 期）阻滞来降低结肠癌细胞的增殖；Hu 等[17]指出AIM2 的缺失可以通过标靶肝脏中的纤维连接蛋白-1（FN1）来促进了上皮-间质的转化（EMT）；他们的研究表明，新发现的HBx/AIM2/FN1 轴是肝细胞癌转移的一个新的潜在治疗靶点。AIM2 的下调可以使侵袭蛋白酶MMP1 和MMP13 的表达下调[13]，从而导致皮肤鳞癌细胞侵袭能力的降低，AIM2 的下调也能导致体内皮肤鳞癌异种移植物的生长和血管化受到抑制[13]。这些研究结果为AIM2 在肿瘤进展中的作用提供了证据，并提示AIM2 炎性小体有可能作为这些侵袭性和转移性肿瘤的潜在治疗靶点，因此，AIM2 可能在不同的癌症类型中发挥独特的作用。

而CASP6 则在促进细胞凋亡和坏死性凋亡中起着重要作用，并且已被证明可以调节炎性小体的激活，包括NLRP3、ASC 和CASP1 的激活，从而促进GSDMD 诱导的焦亡[18，19]。在本研究中，CASP6 与膀胱癌患者的OS 负相关，因此，CASP6可能作为促癌基因在膀胱肿瘤组织中富集。重要的是，Yao 等[20]提出的证据表明，CASP6 可以通过调节4T1 肿瘤相关巨噬细胞中MMP-2 和MMP-9的表达来调节乳腺癌细胞的侵袭；体外研究中，CASP6蛋白水平或活性的降低抑制了肿瘤细胞的侵袭。对于卵巢癌细胞，CASP6 的过表达和细胞质局限化可能与层粘连蛋白A 的降解和缺乏有关[21]。对于胃癌和结直肠癌，Lee 等发现CASP6在60%的胃癌和90%的结直肠癌中表达，表明CASP6 基因偶尔会发生突变[22]，这些数据还表明CASP6 缺乏可能与胃癌的发病机制有关。虽然CASP6 可能是影响癌症患者生存的重要基因，但其提高膀胱癌患者生存率的具体机制仍需进一步探索。鉴于膀胱的数据有限，不同肿瘤的结果往往相互矛盾，我们关于AIM2 和CASP6 的研究结果为进一步的研究提供了一些见解，我们的研究发现2 个基因（AIM2、CASP6）可能是BLCA 中焦亡的执行者，6 个基因（CASP9、PRKACA、CASP6、TNF、AIM2、GSDMB）可能对焦亡起了调节作用，而另一个重要发现是上述2 个PEGs 与免疫浸润显著相关，进一步证实了焦亡在肿瘤免疫微环境中起着至关重要的作用。

我们还构建了mRNA-miRNA-lncRNA 网络和CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG 调控轴。hsa-let-7c-5p 属于保守的let-7 家族，是已被充分研究的与许多癌症类型有关的miRNA 之一[23～25]。Hsa-let-7c-5p 在多种癌症类型中下调，如非小细胞肺癌[26]、胰腺癌[27]和前列腺癌[28]。而Pudova等[29]利用生物信息学和实验工具研究发现，在三阴性乳腺癌中，与PFS 相关的C1orf132（也称为MIR29B2CHG）和MIR29B2CHG（rs=0.31）lncRNA的表达显著下调。在本研究中，我们发现hsalet-7c-5p和MIR29B2CHG lncRNA与膀胱癌患者的预后显著相关。这些证据表明CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG lncRNA 调控轴也可能在膀胱癌的进展中发挥重要作用，可进行进一步研究来验证。

当然，我们的研究也有一定的局限性。首先，我们的样本是来自TCGA 数据库的回顾性公开数据，需要进一步的前瞻性队列数据来验证。其次，我们构建的预后模型中只包含6 个PRGs，许多与焦亡无关的有价值的基因可能被排除在外。综上，我们研究表明细胞焦亡与膀胱癌密切相关，全面的生物信息学分析为预测膀胱癌患者的预后提供了新的基因标记，并为进一步研究膀胱癌中PRGs与免疫之间的关系提供了重要的基础。