牛膝多糖对雏鸡免疫功能的影响

桂文龙，苏治国，刘运镇，马润泽

（江苏农牧科技职业学院动物医学院，江苏泰州 225300）

牛膝多糖（Achyranthes bidentata Polysaccharides，ABPS）是一种从苋科植物牛膝中提取的小分子化合物（陈辉，2018）。植物牛膝是苋科多年生草本植物，具有 “补肝肾，强筋骨，逐瘀通经，引血下行” 等功效（王长斌等，2020）。牛膝多糖作为牛膝的主要功能成分之一，具有水溶性好、相对分子质量小、易吸收和抗原性好等优点（欧淑琦等，2018）。从植物牛膝中提取得到的牛膝多糖具有增强机体免疫功能、抑制肿瘤生长和提高白细胞活性等生理功能（欧淑琦等，2019）。目前，世界各国多项研究表明，在动物饲料中添加一定量的中药或其活性成分具有促进动物生长，增强机体免疫力，防病、抗病等功能。为此，本试验研究牛膝多糖对雏鸡免疫功能的影响，为临床治疗提供参考。

1 材料

1.1 试验动物 1 日龄健康雏鸡（120 只），由江苏农牧科技职业学院实验动物房提供。

1.2 试验材料 牛膝多糖（目数：80 ～120 目，规格：10 ∶1 20 ∶1）购于宁夏香草生物技术有限公司；MTT 试剂盒（型号：M1020，规格：500T）购于上海科艾博生物技术有限公司；ELISA 试剂盒（型号：LM-0068E，规格：48T）购于上海科顺生物科技有限公司；Griess 试剂（型号：SY6046，规格：10g）购于上海源叶生物科技有限公司；PHA（聚羟基脂肪酸酯）（型号：P0028，规格：5mg）购于上海宝曼生物科技有限公司。

1.3 常规饲料 本试验常规饲料主要组成及营养水平如下表1。

表1 常规饲料组成及营养水平（风干基础）

1.4 主要仪器设备 恒温培养箱（HPX-9082MBE）、电子天平（HZF-A+300）、高速离心机（TGL-16gR）、冰箱（BCD-238S）、压力蒸汽灭菌锅（LDZX-400）酶标仪（MB16-414）等，均由江苏农牧科技职业学院传染病实验室提供。

2 试验方法

2.1 试验动物分组与处理 将120 只1 日龄雏鸡随机分为4 组，每组3 个重复，每个重复10 只雏鸡（公母各半）。分别在4 组常规饲料中添加不同剂量的牛膝多糖，低剂量组添加100 mg/kg ；中剂量组添加150 mg/kg ；高剂量组添加200 mg/kg ；对照组未添加牛膝多糖。将所有试验雏鸡连续饲喂30 日龄，每组取10 只进行取样。

2.2 血清样品采集 利用颈静脉采血法采集血量10 mL/ 只，将采集的血液以3000 r/min 的速度离心10 min，制备血清，-20℃保存备用。

2.3 免疫器官指数 将试验雏鸡禁食12 h 后称重，颈静脉放血处死，剖解取出胸腺、脾脏和法氏囊，用生理盐水清洗，去除表面多余羽毛等杂物，用吸水纸吸干表面水分。电子天平称量各免疫器官的重量，计算免疫器官指数，具体公式如下：

2.4 T 细胞增殖活性 无菌采集试验雏鸡的胸腺、脾脏，去除表面包膜，将其剪碎，用胰酶消化，使红细胞裂解，RPMI-1640 调节细胞浓度为5×106/mL。取96 孔反应板，每孔加入100μL，每个测试做3 个重复，并设空白对照，加含PHA的RPMI-1640，每 孔100μL，37 ℃恒 温 培 养68 h，每孔弃去100μL 上清液，按照MTT 试剂盒说明书对T 细胞增殖活性进行测定，并于酶标仪570 nm 处读取各孔A 值，计算T 细胞增殖率，具体计算公式如下：

2.5 巨噬细胞释放NO 能力 将脾细胞浓度调整至1×107个/mL，于24 孔反应板中每孔加入1 mL；再加入含10% FBS 的RPMI-1640 培养液1 mL，37℃细胞培养2 h 使其贴壁；用PBS洗细胞2 次，每孔加入细胞培养液0.5 mL，培养24 h ；将上清液收集于96 孔反应板，每孔加入100μL，每个样品3 个重复；在96 孔反应板中加入不同浓度的NaNO2标准品，每孔100μL；各孔加入Griess 试剂100μL，室温下静置10 min，在酶标仪550 nm 处读取A 值。

2.6 血清总IgG 按魏婧瑶等（2018）报道的步骤操作，测定雏鸡血清中总IgG 的水平。酶标板中先后加入标准品稀释液或样品100μL/ 孔、抗体稀释液50μL/ 孔，封板，振荡孵育3 h，加入辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白100μL/ 孔，封板后室温孵育30 min，弃液洗板，在各孔依次加入显色剂底物TMB 和终止液，30 min 内读取吸光值，测定血清中总IgG 的水平。所有试剂在使用前均先平衡至室温，标准品和样品均需做3 个重复，且每次分析均做标准曲线。

2.7 数据统计与分析 将所有试验数据录入SPSS 24.0 进行单因素方差分析，采取SNK 法进行两两比较，结果以 “平均值± 标准差” 表示，P＜0.05 表示组间差异显著。

3 结果

3.1 对免疫器官指数的影响 由表2 可知，各试验组牛膝多糖对雏鸡胸腺指数存在明显差别，中剂量组和高剂量组胸腺指数与低剂量组和对照组差异显著（P＜0.05），中剂量组和高剂量组之间差异不显著（P＞0.05）；中剂量组和高剂量组法氏囊指数与低剂量组和对照组差异显著（P＜0.05），中剂量组和高剂量组相比差别不显著（P＞0.05）；各试验组雏鸡脾脏指数无显著差异（P＞0.05）。

表2 牛膝多糖对雏鸡免疫器官指数的影响

3.2 对T 细胞增殖活性的影响 由表3 可知，各试验组雏鸡T 细胞增殖活性A 值与对照组差异显著（P＜0.05），各试验组之间的差异不显著（P＞0.05）。

表3 牛膝多糖对雏鸡T 细胞增殖活性A 值的影响

3.3 对巨噬细胞释放NO 能力的影响 由表4 可知，各试验组雏鸡的巨噬细胞释放NO 水平上，高剂量组与对照组和低剂量组差异显著（P＜0.05），中剂量组与高剂量组、中剂量组与低剂量组和对照组差异不显著（P＞0.05）。

表4 牛膝多糖对雏鸡巨噬细胞释放NO 能力的影响

3.4 对血清总IgG 的影响 由表5 可知，各试验组雏鸡血清总IgG 水平与对照组差异不显著（P＞0.05），高剂量组与低剂量组之间、各试验组之间差异显著（P＜0.05）。

表5 牛膝多糖对雏鸡血清总IgG 水平的影响

4 讨论

4.1 牛膝多糖对雏鸡免疫器官指数的影响 动物机体的自身免疫系统包括自身的免疫器官、免疫细胞及免疫分子，禽类免疫器官主要是胸腺、脾脏及法氏囊等。其中胸腺作为T 淋巴细胞在机体内产生的基础部位，主要参与机体的细胞免疫；法氏囊是B 淋巴细胞产生和分化的部位，主要参与体液免疫；脾脏则是禽类最大的外周免疫器官，是免疫应答的重要场所，也是产生抗体和效应细胞的重要场所（张潇等，2021）。免疫器官指数是衡量动物免疫器官发育状况、体质量变化进而间接反映动物应对外界应激能力的重要指标（Wu等，2018）。

本试验可知，牛膝多糖可使雏鸡胸腺、脾脏和法氏囊的指数增长，增强机体抵抗病原能力。这与其他学者的研究相似，如雷莉辉等（2017）将不同剂量的香菇多糖添加在肉仔鸡饲料中，其免疫器官指数显著高于对照组。方磊涵等（2018）报道，中药复方多糖组的胸腺指数与对照组差异显著或极显著。

4.2 牛膝多糖对雏鸡T 细胞增殖活性的影响淋巴细胞是动物机体最重要的免疫细胞，淋巴细胞的增殖和分化是机体在免疫应答过程中最重要的阶段，其增殖程度是反映机体细胞免疫水平的一个重要指标（朱轶锋等，2018）。T 细胞主要介导细胞免疫，其增殖分化的能力越强，对侵入机体病原的抵抗能力就越强。

本试验发现，牛膝多糖可有效提高雏鸡T 细胞的生长和增殖活性。张萍等（2015）报道，灵芝多糖既可以单独促进鸡外周血淋巴细胞增殖，也可以与ConA 共同促进鸡外周血淋巴细胞增殖。

4.3 牛膝多糖对雏鸡巨噬细胞释放NO 能力的影响 在动物免疫系统中，巨噬细胞参与了机体的特异性免疫和非特异性免疫，并通过吞噬机体各种有害物质、递呈各种类型的抗原及其分泌细胞因子等方式来发挥其免疫调控作用，NO 的自我分泌也是巨噬细胞生长和活化的主要特点之一。

本试验发现，牛膝多糖可促进巨噬细胞释放NO，更好地发挥抗菌作用。崔小珍等（2020）试验结果表明，松针多糖可促进巨噬细胞iNOS 的表达，提高NO 的生成，进而促进巨噬细胞的吞噬能力。

4.4 牛膝多糖对雏鸡血清总IgG 的影响 IgG 是动物体内的主要抗体之一，含量最高，可以通过血管壁渗透到组织中去，具有广泛的抗传染作用，还具有调理、凝集和沉淀抗原的能力。

从本试验结果发现，牛膝多糖可以提升雏鸡血清总IgG 水平。Li 等（2020）研究表明，饲料中添加鹰山玄武绿茶多糖可增加胸腺和法氏囊的重量和血清中IgA 和IgG 的浓度。

5 结论

综上所述，在雏鸡常规饲料中添加不同水平的牛膝多糖在一定程度上能提高机体免疫器官指数、T 细胞增殖活性、巨噬细胞释放NO 能力和血清总IgG 水平，对增强雏鸡免疫功能有一定作用。在本试验条件下，牛膝多糖的最适添加量为150 mg/kg。