基于p38 MAPK信号通路探讨生慧颗粒对AD模型大鼠EC与CA1区影响及作用机制＊

李泽飞，赵宾宾，石和元，王 平＊＊

（1.湖北中医药大学基础医学院 武汉 430065；2.江汉大学医学部 武汉 430056）

阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的进行性神经退行性疾病，其特征是大脑中出现细胞外老年斑和细胞内神经原纤维缠结，导致进行性认知能力下降和神经元细胞死亡[1]。经典观点认为，淀粉样蛋白斑块导致的结构损伤和神经元丢失是AD 认知障碍的基础。但现有研究发现，AD 在早期阶段即有不同脑区间环路交流功能障碍和神经元异常放电[2]。越来越多的数据表明，大脑神经网络的改变可以解释AD 的早期发病机制，这些神经环路异常甚至先于典型的Aβ 沉积。海马CA1 区是一个信号汇集点，可以接收来自上游脑区的电信号输入[3]，其中单突触回路内嗅皮层（Entorhinal cortex，EC）-CA1 一直被认为是学习和记忆的重要回路基础[4]。

丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族包括细胞外信号调节激酶（Extracellular signal regulated kinases，ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c Jun N terminal kinase，JNK）和p38 MAPK 等亚族。其中p38 MAPK 在中枢神经系统的神经元和非神经元细胞中高度表达。有研究发现，AD患者大脑中p38 MAPK 活性增加[5]。p38 MAPK 与AD发病机制中的许多病理过程有关，其中与Aβ、Tau 蛋白过度磷酸化、神经炎症、突触可塑性关系较为密切[6]。Aβ 沉积形成的淀粉样斑块是AD 的病理标志之一，Aβ 可激活p38MAPK 导致细胞内钙、活性氧产生/积累和线粒体应激增加，促进AD 病理的发生与发展。过度磷酸化tau 蛋白形成的神经纤维缠结是AD 另一种主要病理特征。上调p38 MAPK 的表达可以促进Tau 蛋白过度磷酸化和沉积，引发神经毒性和突触功能障碍[7]。在生理情况下Tau 蛋白主要富集在神经元的轴突部位，Tau 蛋白高度磷酸化导致其未能与微管结合，这会导致细胞骨架稳定性的下降和轴突运输的受损，从而导致突触功能障碍。另外，Aβ 引起的过度细胞应激可能诱导星形胶质细胞释放TNF-α、IL-1β和一氧化氮等促炎介质，导致脑内的慢性炎症状态。而p38 MAPK 可被许多细胞外炎症介质激活，并进一步通过调节转录因子产生促炎细胞因子，导致慢性神经毒性[8]。p38 激活还可以抑制长时程增强（Longterm potentiation，LTP），使海马突触可塑性降低[9]。突触是直接参与神经系统内信息整合和传递的结构，突触可塑性是调控神经功能的基础。EC-CA1神经回路间顺利交流依赖于突触结构及功能正常。因此，通过抑制p38MAPK 信号通路激活来改善突触功能障碍和恢复突触可塑性是治疗AD的有效途径。

东莨菪碱是一种非选择性毒蕈碱乙酰胆碱受体拮抗剂，东莨菪碱处理的动物通常用作研究AD 的动物模型。腹腔注射东莨菪碱的AD 动物模型除具有认知功能障碍外还具备多种AD 特征，如氧化损伤、线粒体功能障碍和Aβ 病理学特征等[10]。乙酰胆碱在记忆过程中发挥作用，但也在运动和焦虑相关行为中发挥作用。因此，东莨菪碱阻断受体可导致认知和运动缺陷，并可导致焦虑。

中医药治疗痴呆注重早期干预、综合防治。早在《辨证录·健忘门》即有生慧汤治疗老年人健忘症的记载，该方由熟地、山茱萸、远志、生酸枣仁、柏子仁（去油）、茯神、人参、石菖蒲、白芥子组成。人参、熟地、山茱萸功能培元补肾；生酸枣仁、柏子仁、茯神功能养心安神、助眠益智；远志、石菖蒲、白芥子功能祛痰开窍、健脑益智，全方共奏培元健脑、安神益智之功。团队前期研究发现生慧汤不仅能提高APP/PS1 双转基因AD模型小鼠学习记忆能力，降低海马炎症相关蛋白表达[11]，还能提高慢性睡眠剥夺模型小鼠认知能力，对神经具有保护作用[12]。在此基础上本团队依据生慧汤研发了生慧颗粒[13]。但是以往的研究仅局限于海马脑区，在本研究中，拟使用生慧颗粒干预东莨菪碱致痴呆模型大鼠。使用行为学实验评价大鼠学习记忆能力及焦虑样行为，使用相关染色观察EC和海马体病理损伤情况与神经元活性，使用Western blot 检测海马p38 信号通路相关蛋白，从而探讨生慧颗粒能否通过调节p38信号转导从而改善海马突触功能障碍及细胞凋亡。

1 材料和方法

1.1 试剂与实验仪器

生慧颗粒由李时珍医药集团生产（批号202112001），成人剂量每日3 袋，每袋18 g。氢溴酸东莨菪碱注射液（华牧动物保健品有限公司，批号20210601）、多奈哌齐（卫材药业有限公司，批号2010015）。各种一抗：c-Fos（爱博泰克，中国，A16641），p38（万类生物，WL00764），p-p38（万类生物，WLP1576），Tau（爱博泰克，A0002），p-Tau（爱博泰克，AP0053），Bax（爱博泰克，A0207），Bcl-2（爱博泰克，A0208），β-actin（abcam，ab8226）。

旷场实验视频跟踪仪器（Ethovision-XT 16.0，诺达思（北京）信息技术有限责任公司）；水迷宫视频跟踪系统（V1.19，安徽正华生物仪器有限公司）；病理切片扫描仪（Pannoramic Scan，匈牙利3DHIESTECH 公司），凝胶成像系统（GelDoc XR，美国伯乐公司）。

1.2 动物和实验组

40 只雄性SD 大鼠（5 周龄），体质量200±20 g 购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验单位使用许可证编号：SYXK（鄂）2017-0067。让大鼠适应环境5天，自由饮食。房间条件保持在12 h/12 h 的明暗循环、55%湿度和22±2℃温度。动物实验经湖北中医药大学动物伦理委员会批准。生慧颗粒给药剂量按照成人与大鼠等效剂量换算，结果为4.86 g·kg-1。将大鼠随机分为四组（每组10只），即空白组、模型组、生慧颗粒组、多奈哌齐组。给药处理如下：空白组（超纯水灌胃），模型组（超纯水灌胃），生慧颗粒组（生慧颗粒4.86 g·kg-1·d-1，灌胃）和多奈哌齐组（多奈哌齐1 mg·kg-1·d-1，灌胃）。实验持续28 天，在前18 天，各组大鼠进行灌胃处理，第19-28 天除灌胃外还进行行为学实验，在测试开始前30 min 对大鼠进行腹腔注射处理。除空白组外，其余各组每日腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液5 mL·kg-1·d-1。空白组腹腔注射等剂量生理盐水。行为学实验结束后将所有动物处死。

1.3 Morris水迷宫测试

使用Morris 水迷宫测试评价大鼠长期空间学习和记忆能力。水迷宫为一个直径150 cm、高100 cm的圆柱水箱，箱中充满了含有黑色墨水的水（23±1℃），并在水箱周围的墙壁上放置了图案提示。一个平台被淹没在水面以下1 cm 处，以防止大鼠看到平台。寻找水下隐藏平台的训练持续5 天，每天从不同象限训练4 次。到达平台后，让大鼠在平台上休息20 s。将90 s 内未能找到平台的大鼠引导至平台并让其在平台上停留20 s。第6 天大鼠暂停水迷宫行为学实验。第7 天撤走水下平台，让大鼠自由游泳90 s。使用水迷宫视频跟踪系统分析游泳路径和时间，并计算上平台潜伏期，穿越平台次数和目标象限停留时间百分比。

1.4 旷场测试

使用旷场测试评估大鼠运动状态及焦虑等相关行为。该装置由黑色地板（100 cm×100 cm）组成，周围有50 cm 高的黑色墙壁。测试开始时，将动物置于空旷场地的角落，让其自由探索5 min。在探索过程中，使用视频跟踪软件记录运动轨迹并计算穿越中心区域（50 cm×50 cm）次数和停留时间以及总运动路程。

1.5 HE染色

大鼠处死后，将全脑在10%福尔马林中保存过夜，然后在石蜡中包埋4 h。制备石蜡块，用切片机切取海马CA1、CA2、CA3 和EC 区的冠状切片。切片固定在硅烷涂层的载玻片上，在二甲苯中洗涤以脱蜡，在分级乙醇中再脱水，最后用苏木精-伊红（HE）染色。使用病理切片扫描仪对染色切片全扫描并观察海马各区神经元形态。

1.6 c-Fos免疫荧光染色

将冠状脑切片用0.4% Trition X-100 渗透并用10%正常驴血清封闭，然后在4℃下使用一抗c-Fos（1∶300）孵育过夜。然后将切片在0.4% Trition X-100中洗涤3 次，每次30 min，然后在室温下用适当的二抗孵育1 h。

1.7 蛋白质印迹分析

提取海马组织总蛋白，使用BCA 蛋白检测试剂盒测定提取蛋白浓度。使用4%-10% SDS-PAGE 电泳分离蛋白，随后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。室温条件下使用5%无脂牛奶中封闭1 h，并在4℃下与相应一抗孵育过夜。洗涤后与相应二抗孵育。使用超敏ECL 进行显色，凝胶成像系统对染色拍照。使用Image J软件对条带进行半定量分析。

1.8 统计分析

2 实验结果

2.1 生慧颗粒改善AD大鼠中长期空间学习记忆

图1A 为大鼠定位航行及空间探查实验轨迹图。如图1B 所示，经过5 天的水迷宫训练，所有组的逃避潜伏期逐渐降低。到第5 天，空白组、生慧颗粒组、多奈哌齐组大鼠的逃逸潜伏期分别为21.7±6.3 s、37.9±9.8 s、31.1±8.8 s。然而，模型组的逃逸潜伏期从为52.4±9.5 s，明显高于其他组。

图1 Morris水迷宫结果

图1C 显示了第7 天各组大鼠穿越平台次数。与空白组（4.4±0.8）比较，模型组（1.1±0.6）穿越平台次数明显减少（P<0.01）。与模型组比较，生慧颗粒组（3.1±1.1）和多奈哌齐组（3.5±0.8）均高于模型组（P<0.01，P<0.01）。

图1D 显示了大鼠目标象限中停留时间的比值，模型组目标区停留时间百分比为（24.1%±3.4%），明显低于空白组（34.0%±4.3%）（P<0.01）。生慧颗粒组（31.0%±4.3%）和多奈哌齐组（28.8%±3.1%）在目标区的游泳时间百分比均高于模型组，但生慧颗粒组具有显著性差异（P<0.05），多奈哌齐组不具有显著性差异（P>0.05）。

2.2 生慧颗粒减轻AD大鼠的焦虑抑郁样行为

图2A为大鼠旷场实验轨迹热图。图2B显示大鼠在中心区停留的时间，与空白组（4.5±2.0 s）比较，模型组大鼠（1.2±0.7 s）停留的时间显着减少（P<0.01）。与模型组比较，生慧颗粒组（3.2±0.9 s）和多奈哌齐组（3.4±1.0 s）大鼠在中心区停留的时间显著升高（P<0.05，P<0.05）。

图2 旷场实验结果

图2C 显示大鼠进入中心区次数，与空白组（3.3±0.9）相比，模型组大鼠（0.7±0.6）在进入中心区次数显着减少（P<0.01）。与模型组比较，生慧颗粒组（2.2±0.6）和多奈哌齐组（1.7±0.8）大鼠进入中心区次数均显著升高，但生慧颗粒组具有显著性差异（P<0.01），多奈哌齐组不具有显著性差异（P>0.05）。

图2D 显示大鼠总运动路程，与空白组（3467.2±692.4 cm）相比，模型组大鼠（652.3±272.9 cm）总运动路程显着减少（P<0.01）。与模型组比较，生慧颗粒组（2464.2±699.7 cm）和多奈哌齐组（2701.0±585.8 cm）大鼠总运动路程均显著升高（P<0.01，P<0.01）。

2.3 生慧颗粒减轻AD大鼠脑组织神经病理损伤

如图3 所示，空白组（图3A）EC 区与海马CA1 区神经元排列整齐，而模型组（图3B）大鼠神经细胞可观察到明显的嗜酸性细胞质、核固缩、神经元肿胀、锥体细胞收缩和空泡化。与模型组比较，生慧颗粒组（图3C）与多奈哌齐组（图3D）治疗后嗜酸性染色的神经元数量较少，显示出轻微的神经元毒性，核固缩与空泡化均有所减轻。这表明生慧颗粒对海马区与EC区组织中具有潜在的保护作用。

图3 海马与EC区皮层H&E染色结果

2.4 生慧颗粒提高AD大鼠海马及EC区神经元活性

图4A 显示各组大鼠海马区c-Fos 免疫荧光染色，与空白组比较，模型组c-Fos 荧光表达降低。与模型组比较，生慧颗粒组与多奈哌齐组c-Fos 荧光表达升高。各组大鼠海马组织蛋白质印迹数据（图4B、4C）支持免疫染色结果。

图4 海马c-Fos免疫荧光染色与Western blot结果

图5 显示各组大鼠EC 区c-Fos 免疫荧光染色，与空白组比较，模型组c-Fos 荧光表达降低。与模型组比较，生慧颗粒组与多奈哌齐组c-Fos荧光强度升高。

图5 EC区c-Fos免疫荧光染色结果

2.5 生慧颗粒对海马组织p38 MAPK 信号通路的影响

如图6A、6B 所示，通过Western blot 发现，各组海马组织中p38 MAPK 蛋白含量没有较大区别，而模型组大鼠海马中p-p38 MAPK 表达明显比空白组增加（P<0.01）。与模型组比较，生慧颗粒组与多奈哌齐组p-p38 MAPK表达降低（P<0.01，P<0.01）。

图6 p38信号通路Western blot结果

如图6C 所示，各组大鼠海马Tau 蛋白表达无明显差异。与空白组比较，模型组p-Tau 明显比空白组升高（P<0.05）。与模型组比较，生慧颗粒组与多奈哌齐组p-Tau降低（P<0.05，P<0.05）。

如图6D 所示，与空白组比较，模型组大鼠海马中Bax 蛋白表达明显比空白组增加（P<0.01）。与模型组比较，生慧颗粒组与多奈哌齐组Bax 蛋白表达降低（P<0.01，P<0.01）。

如图6E 所示，与空白组比较，模型组大鼠海马中Bcl-2 蛋白表达明显比空白组有所下降（P<0.01）。与模型组比较，生慧颗粒组与多奈哌齐组Bcl-2 蛋白表达升高（P<0.05，P<0.01）。

3 讨论

本实验首先通过水迷宫及旷场实验发现生慧颗粒可以改善东莨菪碱致痴呆AD 模型大鼠学习记忆能力及焦虑抑郁样行为。随后使用HE 染色对CA1 与EC区进行观察，发现生慧颗粒对两部分脑区均有保护作用。空间位置的学习记忆能力是高等生物生存所需的基本适应行为，位于大脑颞叶的海马体对空间认知和情景记忆至关重要[14]。目前的研究发现，运动行为的位置和方向信息在海马CA1 和DG 神经元中编码，破坏其他脑区与CA1 或DG 神经元之间的连接会导致信息解码准确性降低[15]。已有研究表明EC 与CA1区存在广泛联系，EC区负责直接或间接地将信息传递到海马CA1内[16]。AD前期表现为轻度认知障碍，其特征是EC区中显著的神经元丢失，最显着的是II层PC[17-18]。使用逆行单突触追踪系统，已经确定了ECIIPN 和CA1PV 在生理条件下的直接联系[19]（图7A）。

通过c-Fos 染色发现生慧颗粒可提高EC 和CA1神经元活性。神经元细胞活动可改变许多基因的表达，对学习和记忆产生重要影响，其中研究最广泛的一种基因是Fos。有研究表明，神经元活动诱导DNA双链断裂的形成，包括Fos 在内的早期反应基因开始表达[20]。Fos 基因的蛋白质产物为c-Fos，因此c-Fos表达经常用作神经元活动的标志。本研究结果发现模型组c-Fos 在海马和EC 区表达降低。已有文献报道东莨胆碱显著降低了AD 模型小鼠海马中c-Fos 的蛋白水平[21]。结合HE结果发现，生慧颗粒可以同时改善EC与CA1区神经元损伤，提高神经元活性。

为了进一步观察生慧颗粒对突触功能障碍及细胞凋亡的影响，对海马组织内p38 MAPK 通路相关蛋白进行检测，发现生慧颗粒可减弱p38 及Tau 蛋白磷酸化，同时可降低Bax 表达、提高Bcl-2 表达。p38 MAPK 通路级联磷酸化过程为三级激酶模式：MAPK激酶激酶（ASK1），MAPK 激酶（MEK）和p38 MAPK（图7B）。p38 MAPK 信号通路可以被多种胞外信号激活，如Aβ、炎症因子等，经过三级激酶信号转导，p38可诱导细胞凋亡和微管相关蛋白Tau磷酸化。在细胞凋亡途径中，Bcl-2/Bax蛋白在凋亡信号转导中起关键作用。Bcl-2 作为关键的凋亡调控蛋白，可抑制细胞凋亡，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控，其表达减少会引起大量神经细胞凋亡。Bax 则可拮抗Bcl-2产生促凋亡作用。p38可以激活Bax，从而触发细胞色素c 从线粒体中释放，激活半胱天冬酶发生促凋亡作用。Tau 蛋白是一种微管相关蛋白，通常存在于大脑的额叶、颞叶、海马及内嗅区的神经元细胞中。正常情况下，Tau 蛋白具有高度可溶性并且几乎没有聚集倾向，而在神经退行性疾病中可见到Tau 的聚集。另外，Tau 蛋白异常磷酸化会导致细胞内骨架蛋白的解聚和神经纤维缠结，加速了神经元细胞的死亡。研究表明，p38 可以促进Tau 蛋白的异常磷酸化过程，从而加速AD 的病理进程。通过阻断p38 MAPK 活性，可以挽救神经退行性表型[22-23]，因此p38 MAPK 是治疗AD的一个重要靶点。本研究结果表明生慧颗粒通过下调p38 信号转导抑制海马体神经细胞凋亡、减弱Tau磷酸化改善突触功能障碍。结合HE 与c-Fos 染色结果，推测生慧颗粒可能通过保护海马与EC 区神经细胞从而增强EC-CA1回路连接发挥治疗AD作用。

4 结论

综上所述，在本研究中发现生慧颗粒能够改善AD 模型大鼠学习记忆能力和焦虑样行为，对海马和皮层EC 区神经元具有保护作用，同时可提高两部分脑区神经元活性。另外，生慧颗粒可通过p38 信号通路起到抗AD 作用。本研究结果提示生慧颗粒可能通过EC-CA1神经环路治疗AD，后期团队将结合光遗传学做进一步研究。