MTHFD2在肾透明细胞癌中的表达及其与预后和免疫浸润相关性的分析

叶小辉

福建省光泽县医院泌尿外科 354100

肾癌占所有成人恶性肿瘤的2%～3%, 是最常见的泌尿系恶性肿瘤之一[1],其中大约85%的肾癌是肾透明细胞癌(ccRCC)。免疫细胞调节肿瘤细胞进展,其逐渐成为肾细胞癌有效的治疗靶点[2],相关靶基因及免疫检查点的筛选及鉴定已成为晚期肾癌研究的热点。亚甲基四氢叶酸脱氢酶2 (Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase-2,MTHFD2)调节活化 T 细胞中的嘌呤从头合成和信号转导,以促进增殖和炎性细胞因子的产生,是肿瘤潜在治疗靶点[3]。然而,MTHFD2导致ccRCC细胞增殖和免疫浸润的研究仍有待探索。本研究旨在探究MTHFD2在ccRCC中的预后价值及其表达与免疫浸润的相关性,为ccRCC的诊断和预后寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 数据收集 从 TCGA 在线数据库中(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载ccRCC的MTHFD2表达信息及相关临床数据,其中验证队列则采用了来自 EMBL-EBI 数据库(https://www.ebi.ac.uk/)的 E-MTAB-1980 队列[4]。

1.2 MTHFD2在转录水平表达差异 利用 R 包(limma,ggplot2)分析了 TCGA 数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中肾正常组织与肾透明细胞癌组织中MTHFD2转录水平的表达差异。

1.3 MTHFD2表达水平的生存分析 以数据库采集的数据为基础样本,根据MTHFD2表达量的中位值,将病人分为2组:即MTHFD2高表达组和低表达组,以研究其表达与肿瘤总生存期、无瘤间期生存率及疾病特异性生存率的相关性。使用R语言的survminer和survival包描绘生存曲线。

1.4 MTHFD2表达的诊断价值分析 通过R包(pROC包、ggplot2包)对MTHFD2基因表达数据进行 ROC 曲线研究,并通过将其基因水平与临床数据相结合,构建了诺模图以估计病人的年生存率。

1.5 肿瘤免疫细胞浸润与MTHFD2基因表达的相关性 利用TISCH在线数据库 (http://tisch.comp-genomics.org/)探究单细胞水平的MTHFD2。TISIDB 在线网站(http://cis.hku.hk/TISIDB/)分析MTHFD2表达与肾细胞癌中淋巴细胞之间的相关性, CIBERSORT计算肾透明细胞癌中22种肿瘤浸润免疫细胞的相对比率。R包(limma,ggplot2)分析MTHFD2高表达组和低表达组之间22种肿瘤浸润免疫细胞比例的差异, MTHFD2表达与免疫检查点分子间的相关性。

1.6 统计学方法 使用R(4.2.2版本)统计软件对数据进行处理分析,各数据的比较采用t检验和方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFD2的表达与ccRCC患者的临床特征相关 MTHFD2的mRNA在肾细胞癌组织高表达,差异具有重要统计学意义(P<0.001),见图1a;MTHFD2表达与T、N、M分期呈现正向相关性,见图1b～d;预示着MTHFD2高表达与ccRCC不良预后相关。

图1 MTHFD2在ccRCC肿瘤组织及其不同T、N、M分期中的表达

2.2 MTHFD2的表达与ccRCC患者生存概率相关 与MTHFD2低表达的患者相比,MTHFD2高表达患者的总生存期、无瘤间期生存率及疾病特异性生存率明显降低(P值均<0.05),见图2a～c。E-MTAB-1980队列作为独立的验证组,结果显示MTHFD2高表达同样降低肾细胞癌患者的总生存期(P<0.05),见图2d。

图2 MTHFD2的表达与肾透明细胞患者生存期的关系

2.3 MTHFD2表达对ccRCC具有诊断价值 ROC 曲线分析曲线下面积为0.817,表明MTHFD2具有一定的诊断价值,见图3a。通过结合年龄、性别、种族等临床信息,进行单因素以及多因素生存风险分析,最后运用有统计学意义的变量,构建了诺模图,见图3b。

图3 MTHFD2的表达在ccRCC中的ROC曲线图及诺模图

2.4 MTHFD2与免疫浸润有关 单细胞水平的MTHFD2和ccRCC微环境之间的关系, 其中免疫细胞的分布情况见图4a;据图4b, MTHFD2在CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞、NK细胞、树突状细胞等多种免疫相关细胞中表达。

并且在ccRCC肿瘤组织中,CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞及巨噬细胞等免疫相关细胞的表达量与MTHFD2呈现了正向相关性,见图5a。在MTHFD2高表达组中,记忆性CD4+T细胞、M0型巨噬细胞、γδT细胞明显提高;但是,NK细胞、休眠肥大细胞则在MTHFD2低表达组中明显增加,见图5b。MTHFD2表达与肾透明细胞癌中免疫检查点分子之间的关系,见图5c。

图5 MTHFD2与ccRCC免疫细胞浸润及免疫检查点相关

3 讨论

肾癌是一种具有潜在高水平肿瘤异质性和遗传倾向的疾病,ccRCC是最常见的肾癌形式,其组织学特征包括富含脂质和糖原的细胞质沉积物增加,因此让ccRCC引申了一个新的疾病概念,即代谢性疾病。细胞对缺氧或影响 von Hippel-Lindau(VHL) 肿瘤抑制基因的突变的反应稳定了缺氧诱导因子转录因子,缺氧信号与葡萄糖摄取和糖酵解的直接联系在肾癌中已被证实[5]。另外脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢等相关基因对ccRCC的调控作用在相关研究中已得到充分证实。本研究中的MTHFD2作为叶酸代谢的相关基因,为今后开发的专门针对 ccRCC 代谢组的药物提供了新的见解。

免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade,ICB)是一种常用的免疫疗法,并且已经打开了癌症治疗的新格局[6]。免疫检查点是调节T细胞功能的关键分子,其中附着于T细胞表面的程序性死亡受体及表达在肿瘤之上的配体被称为“免疫检查点”,免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors,ICIs)通过抑制二者的结合,从而提高宿主免疫系统对肿瘤细胞的攻击性。最新研究表明,在肾癌患者中,ICIs联合酪氨酸激酶抑制剂能显著提高患者生存率[7]。然而,仍有大多数患者未体验到持久的临床益处,因此合理筛选受益人群、准确预测治疗反应的生物标志物的鉴定仍然是一个待解决的需求。MTHFD2作为新型代谢相关基因,拥有调节活化T细胞中的嘌呤产生的作用[5],而T细胞的耗竭被认为是肿瘤进展的一个重要因素。因此MTHFD2极有可能作为抗多种癌症治疗的新靶点,但暂未有其关于ccRCC的报道,因此本研究试图探讨ccRCC中MTHFD2表达与预后和免疫浸润的相关性。

本研究发现MTHFD2可独立预测ccRCC的预后并影响肿瘤进展,还可刺激免疫细胞如CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞及巨噬细胞等的浸润。先前研究表明MTHFD2影响许多肿瘤的进展和治疗,并与较差的预后及免疫浸润相关[8-9],这与本研究显示相符。MTHFD2亦能通过上调 PD-L1诱导癌症免疫逃逸[10],且本研究发现其与CTLA4、CD80等其他免疫检查点呈现出高度正相关。其中CTLA-4 作为T细胞抑制蛋白,对免疫调节同样重要,缺乏CTLA-4所引发的自身免疫早被证实是致命的[11];它是一种在活化的 T 细胞表面表达的抑制性免疫检查点,它与CD80、CD86结合后 可抑制T细胞活化,进而参与免疫检查点阻滞,诱导肿瘤细胞的免疫逃逸。尽管肾癌中ICB和过继性T细胞疗法的临床成功证明了CD8+T 细胞介导抗肿瘤反应的潜力,但在某些情况下肿瘤仍在进展[12];甚至有研究表明在肾细胞癌中的T细胞浸润与预后不良相关[13]。本研究发现诸多免疫细胞上MTHFD2表达量颇高,遂推测MTHFD2作为一种促癌因子,使免疫细胞反应性增多,并通过某种机制逆转免疫细胞正常功能,使其产生不良预后。因此笔者认为靶向MTHFD2能调节免疫细胞功能,是一种潜在的治疗方法。

总之,本研究采用了相关生物信息学分析,首次阐明MTHFD2在ccRCC中的表达情况,以及其与临床病理、免疫细胞的相关性。然而,本研究样本量较小,且仅为异质性患者,存在一定的局限性,仍需扩大样本量,并进行相关的体外及体内实验以验证以上结论,并探索出具体的作用机制。