捕食性真菌与植物单宁联合制剂对绵羊消化道线虫的杀灭效果

李倩楠,马 园,郝陆瑶,张艳妮,郭志凯,丁玉林,杜 山,王 瑞

(内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室/国家级动物医学实验教学中心,内蒙古呼和浩特 010018)

动物消化道寄生性线虫病是由多种线虫寄生于动物消化道所导致的一类寄生虫疾病,尤对牛、羊等反刍动物危害严重。目前,对于家畜消化道寄生性线虫病的治疗方法主要采取化学药物驱虫的方式,常用药物包括伊维菌素、阿苯达唑等高效广谱驱虫药,且这类药物对于控制家畜消化道寄生性线虫病作用显著[1]。但随着化学药物的使用频次逐渐增多,药物滥用和盲目用药导致的耐药性现象也随之出现并增多,严重影响了驱虫药物的驱虫效果。捕食线虫性真菌普遍分布在自然界中,可将其营养菌丝转化为捕食装置,成功捕杀植物性和动物性寄生线虫[2]。王文蕊与杨晓野等的研究表明,捕食性真菌-驱虫药联合制剂可使幼虫的减少率高达97%以上,而单独使用丙硫咪唑或伊维菌素时,幼虫的减少率分别是83%和61%[3]。捕食性真菌和驱虫药联合制剂的应用,不但可以降低驱虫之后由动物体排出的虫卵对于草场的污染,同时又不影响驱虫药物的效果,防控寄生虫病的作用明显优于单纯化学药物,减轻了当前化学药物防治存在的药物残留、耐药性以及环境污染等问题。

单宁来源广泛,在内蒙古地区有极大的资源,广泛存在于高等维管束植物中,如豆科牧草、油菜籽、高粱籽实、茶叶和蚕豆等籽实及其副产品等。单宁酸添加在饲料中能起到促生长、抗氧化、抗病毒和增强免疫等多种功能,且在畜产品中无残留,动物体内病原菌不易产生抗药性[4]。研究表明,植物单宁可以降低雌虫繁殖,降低粪便虫卵数和体内成虫的数量[5,6]。Novobilsk A[7]进行的研究指出,白坚木树皮提取物含有丰富的单宁,具有抑制Ⅲ期幼虫在寄主体内生存、降低线虫繁殖力和虫卵数量的功效。

研究表明,将捕食性真菌与驱虫药物进行联合应用,为捕食性真菌最有效的临床应用方法,而且捕食线虫性真菌与化学驱虫药物之间没有相互影响。结合资料报道,植物单宁可降低线虫的感染、影响雌虫排卵及通过自身免疫力抵御消化道线虫的定殖发育等[8]。因此,为进一步增强驱虫药与捕食性真菌联合制剂的防治效果,本试验以伊维菌素、捕食线虫性真菌Duddingtoniaflagrans及植物单宁为研究材料,制备驱虫药、捕食性真菌与植物单宁的联合制剂,再将所得制剂进行临床试验,所得结果可以减少化学药物的使用,进而减少对环境的污染,也可为我国兽医寄生虫的防治提供新方法,为植物源杀虫活性物质研究提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与动物 试验菌株为捕食线虫性真菌Duddingtoniaflagrans,保存于-80 ℃低温冰箱,由内蒙古农业大学兽医学院寄生虫学实验室提供。试验用动物为内蒙古乌兰察布市四子王旗个体养殖场饲养的自然感染消化道线虫的绵羊210只,且6个月内没有进行过驱虫。

1.1.2 主要试剂 乳糖、硬脂酸镁、琼脂粉、伊维菌素,吐温-80、PDA固体培养基、玉米粒培养基、孢子洗脱液、生理盐水,北京化学试剂公司产品;单宁酸粉,国药集团有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 真空冷冻干燥机(FD-1A-50),上海比郎仪器制造有限公司产品;光学显微镜(LW600-LT),赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品;压力蒸汽灭菌器(LDZF-75KB),上海申安医疗器械厂产品;台式高速离心机(NEOFNGE 13),湖南湘仪离心机仪器有限公司产品;生化培养箱(SP-02),上海新苗医疗器械制造有限公司产品;电子天平(ESJ-B),赛多利斯(上海)贸易有限公司产品;血细胞计数板(XB-K-25),泽生生物科技有限公司产品;麦克马斯特虫卵计数板(A0008),上海求精生化试剂仪器有限公司产品;单冲压片机(TDP-OT),上海绿翔机械制造有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 捕食性真菌的接种与培养 将D.flagrans真菌在无菌条件下接种到PDA培养基上,直到菌丝布满培养皿表面后,切成0.5 cm×0.5 cm大小的方块,倒置放入新的培养皿之中,培养一周。接着,将在PDA培养基中生长的D.flagrans转接到无菌的玉米粒培养基中并进行充分混匀。随后,在恒温为25℃的培养箱内培养约21 d。

1.2.2 捕食性真菌冻干孢子的制备 为获得高质量捕食性真菌冻干孢子,无菌条件下将培养3周的玉米粒培养基中D.flagrans厚壁孢子用孢子洗脱液反复洗脱后混匀,分装于灭菌的饼干盒中。将饼干盒在-80℃冰箱中预冻2 h后,再将其放在真空冷冻干燥机内1～2 d,待样品为干燥粉末状后,拧紧盖子并用封口膜封口,最后将其贮存于-4℃冰箱备用。

对于D.flagrans冻干厚壁孢子的计数,随机选取3个制备好的冻干孢子盒,从每个盒子中取0.2 g加入10 mL蒸馏水中充分混合,然后使用血细胞计数板进行计数并取平均值,从而得出每克冻干制剂中D.flagrans厚壁孢子的数量。

1.2.3 捕食性真菌-单宁酸-驱虫药物联合制剂的制备 根据口服D.flagrans孢子数为1×106个/kg体重的标准,每公斤体重动物口服冻干制剂的剂量为2.7 mg/kg体重。接下来,按照2015年版《中华人民共和国兽药典》推荐的口服伊维菌素剂量和单宁酸配比称重,推荐剂量分别为0.2 mg/kg体重和20 mg/kg体重,混合充分后备用。

1.2.4 制片辅料用量筛选 利用单因素考察试验方法,确定乳糖和硬脂酸镁的用量对于乳糖的加入量,可将原料与乳糖混合均匀后,采用不同的比例(1∶4,1∶3,1∶2和1∶1)进行压片制粒。加入0.5%的硬脂酸镁后进行压片,并观察颗粒和片剂的外观来确定最佳的乳糖添加比例。对于硬脂酸镁的加入量,按照前一步乳糖最佳比例计算,加入0.5%、0.3%和0.1%不同比例的硬脂酸镁,混匀后压片,比较结果以确定最佳硬脂酸镁用量。按照比例称取原料和乳糖,拌匀后过筛制粒;最后加入硬脂酸镁充分混匀后压片,观察压片情况。

1.2.5 联合制剂中真菌孢子的数量检测 为检测捕食性线虫真菌冻干粉-伊维菌素、捕食性线虫真菌冻干粉-伊维菌素-单宁酸片剂中厚壁抱子的数量,随机取3片捕食性线虫真菌冻干粉-伊维菌素、捕食性线虫真菌冻干粉-伊维菌素-单宁酸片剂并充分捣碎研磨,先向每种片剂中注入10 mL蒸馏水并混匀,然后用血细胞计数板计数,每种片剂测3次,取平均值。

1.2.6 联合制剂对线虫的杀虫效果观察 选择内蒙古乌兰察布市四子王旗王府苏木牧户家自繁自养且6个月之内没有进行驱虫的绵羊共210只。试验前,对选定绵羊进行直肠采粪后使用改良麦克马斯特法,进行线虫虫卵计数:取粪便2 g放入小三角烧瓶或其他玻璃容器中,先将粪便碾碎,后加入饱和食盐水 58 mL,充分混匀后,用吸管把搅匀后的粪液注到麦氏计数室中,放在显微镜上,静置3 min后计数。根据每克粪便虫卵数(EPG)检查结果,选取EPG≥300的绵羊210只作为试验动物并对其编号。得出每克粪便虫卵数后,按照EPG进行蛇形分组。共分为7组,每组30只,按照体重灌服相应数量的制剂。灌服1周后同法检测EPG,进而分析制剂是否对绵羊消化道线虫有驱虫作用。

1.2.7 数据统计与分析 试验数据使用Microsoft Excel 2013软件整理,试验数据用“平均值±标准差”来表示。采用Graphpad 8.0软件中的单因素方差分析进行显著性检验。

2 结果

2.1 捕食性真菌冻干孢子粉的制备结果

冻干厚壁孢子粉呈棕黄色疏松海绵状固体,抽取3份样品,对其中的厚壁孢子进行计数,结果孢子数量为4.56×109个/g。

2.2 辅料用量结果

对于乳糖用量,当乳糖与原料的比例为1∶1、1∶2和1∶3时,制得颗粒和片剂合格;而1∶4比例制得的片剂颗粒不均、细粉较多。减少乳糖用量可保证压片外观良好、易于成形。综上所述,以1∶3比例为宜,实现用量最少。对于硬脂酸镁用量,0.5%和0.3%的硬脂酸镁压片情况都符合压片要求,0.1%硬脂酸镁有粘黏现象。硬脂酸镁起润滑作用,在直接压片中用作助流剂,硬脂酸镁的含量过高,会导致粉末流动性很强,分层结构导致压出的片剂硬度不好。所以选择使用0.3%的硬脂酸镁。

2.3 联合制剂对于绵羊消化道线虫杀虫效力试验结果

对试验地210只绵羊进行直肠采粪EPG检测,由EPG检测结果发现,210只试验羊中137只存在消化道蠕虫感染,感染率为65.20%,消化道线虫感染率73.14%,绦虫感染率2.06%,吸虫感染率为0。根据试验结果各组绵羊用药前后粪便中线虫虫卵数量(EPG)平均值和虫卵减少率得知伊维菌素组虫卵减少率为-22.1%(表1),初步预测当地虫株对伊维菌素出现了耐药性。A、C、D、E和F组在用药后虫卵均有不同程度的减少,其中D.flagrans-伊维菌素-单宁酸组虫卵减少率最高,杀线虫效果最好(图1)。

相同字母表示差异不显著(P>0.05),相邻字母表示差异显著(P<0.05),相间字母表示差异极显著(P<0.01)。A.捕食性线虫真菌;B.伊维菌素;C.单宁酸;D.伊维菌素-单宁酸;E.D.flagrans-伊维菌素;F.D.flagrans-伊维菌素-单宁酸;G.空白对照组

表1 用药前后平均EPG值

2.4 片剂中捕食性真菌孢子的数量统计

D.flagrans-伊维菌素片剂厚壁孢子平均个数为(3.31±0.834)×107个/粒,D.flagrans-伊维菌素-单宁酸片剂厚壁孢子平均个数为(3.250±0.522)×107个/粒。

3 讨论

Lopes S G[9]等发现,食用富含单宁紫荆的食物可有效驱虫,对山羊的驱虫效果显著。一般认为,单宁酸有两种抗寄生虫机制:一是通过营养免疫,缩合单宁可保护蛋白质在反刍动物瘤胃中不遭降解,进而增强动物机体吸收营养物质的能力,从而提高机体抵抗疾病的能力,间接地起到抗寄生虫作用[10];二是缩合单宁可通过代谢阻断途径对寄生虫的生长发育产生影响,干扰其许多重要的生物学过程。

为确定伊维菌素、捕食线虫性真菌D.flagrans及植物单宁联合制剂杀绵羊消化道线虫作用的效果,本试验EPG检测结果发现,当地绵羊消化道蠕虫感染率为65.20%,其中消化道线虫感染率为63.14%,绦虫感染率仅为2.06%,吸虫感染率为0。

根据本试验结果,伊维菌素组虫卵减少率为22.1%,初步预测当地虫株对伊维菌素出现了耐药性,根据粗略的走访得知,当地牧民的驱虫药物主要为伊维菌素和阿苯达唑,其中伊维菌素的使用率最高,且走访兽药店得知,伊维菌素类药物销售额最大,这是当地出现伊维菌素耐药性的主要原因。根据试验结果可知,与空白对照组相比,各用药组绵羊粪便中线虫虫卵数量均有所减少,但是作用均不明显,捕食线虫性真菌D.flagrans主要是作用于幼虫的,对虫卵的作用较小,且人们也是将DF作为与药物的联合制剂使用,较少作为单一制剂使用。研究显示,单宁对消化道线虫有杀虫作用,但是大多数人们把单宁作为饲料添加剂使用,本试验结果显示,单宁对消化道线虫有杀虫作用,但没有显著效果,不能作为单一制剂使用。根据虫卵抑制率试验结果可知,与空白组对比,其余6组结果差异显著(P<0.05),说明其余药物均有作用。与伊维菌素单一制剂组对比,其余6组结果均差异显著(P<0.05),添加了D.flagrans及单宁的联合制剂效果均优于单一使用伊维菌素组,伊维菌素-D.flagrans-单宁联合制剂优于单一制剂组及双制剂组,有着明显的增效作用。总之,试验结果表明成功制备了生物制剂与药物的联合制剂,动物试验表明该制剂具有一定杀虫效果。单宁酸有一定驱线虫作用;植物单宁、驱虫药与捕食性真菌联合制剂的防治效果优于单一组分组。试验结果为绵羊消化道线虫防治提供了新方法,为植物源杀虫活性物质研究提供了参考数据。