牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

刘 丹,黄小洁,吴华伟,孙 淼,陈延飞,秦义娴,侯力丹,薛 麒

(中国兽医药品监察所,北京 100081)

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种以发热、腹泻、繁殖障碍为主要症状的接触性传染病[1]。易感动物除牛以外还能感染羊、骆驼、鹿等其他反刍动物[2-4],其造成的动物繁殖能力下降,给养牛业造成了持续的经济损失,是影响养牛业发展的重大疫病之一[5-6]。BVDV在妊娠早期穿过胎盘可能导致持续感染小牛的出生,持续感染的动物通常比短暂或急性感染的动物更能有效地传播 BVDV,它们能够在一生中释放大量病毒,被认为是 BVDV 的主要储存库。该病呈世界性分布,广泛分布于美国、澳大利亚、新西兰等养牛发达国家。BVDV与猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、羊边界病毒(Border disease virus,BDV)同属于黄病毒科瘟病毒属,且与CSFV和BDV在血清上存在交叉反应。BVDV分为BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3型,是一种长度约12.3kb的单股正链RNA病毒,BVDV基因组开放阅读框(ORF)编码一个大的多聚蛋白,经翻译和加工后形成C、Ems、E1、E2、Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B共12种蛋白,其中E2蛋白位于病毒的外表面,是构成病毒的主要免疫保护抗原,能诱导机体产生中和抗体。

BVD在我国普遍存在,感染情况比较严重,缺乏有效的治疗方法,所以有必要开展检测及种群的净化工作。世界上许多国家的控制程序主要依赖于对持续性感染(PI)动物的检测,早期检测PI 动物特别是在出生后不久检测对于实施BVDV控制计划具有重要意义。现有的诊断方法如病毒分离、免疫组织化学、抗原捕获酶联免疫吸附试验和逆转录酶聚合酶链式反应,每种检测方法都有各自的优缺点,并且适用于不同的诊断情况[2,5,7]。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有操作简单、敏感性和特异性好等优点,被广泛用于牛群BVDV的检测和诊断。本研究对BVDV-1标准株C24V株的E2蛋白进行分析和表位预测,利用杆状病毒表达E2蛋白,建立基于E2蛋白的BVDV抗体间接ELISA检测方法,以期为BVDV防控净化和临床检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株和细胞 真核表达质粒pFastBac1-E2,大肠埃希氏菌DH10Bac,Invitrogen公司产品;Sf9昆虫细胞,中国兽医样品监察所保存。

1.1.2 主要试剂 BVDV标准阳性血清和阴性血清,BVDV临床样本血清,牛副流感病毒3型(BPIV3)阳性血清,牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)阳性血清,牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)阳性血清,中国兽医药品监察所保存;质粒小提试剂盒,美国OMEGA公司产品;Sf900Ⅱ培养基,庆大霉素,氨苄青霉素,四环素,X-gal,IPTG,蛋白定量试剂盒,美国Invitrogen公司产品;FuGENE 6转染试剂,美国Promega公司产品;明胶,辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛IgG,蛋白预染Marker,TMB单组份显色液,终止液,包被液,中国北京索莱宝生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 小垂直板电泳槽(Mini-PROTEAN Tetra),美国Bio-Rad公司产品;倒置显微镜,美国Nikon公司产品;酶标仪(MD SpectraMax Plus384),美国Molecular Devices公司产品;低温培养箱(Friocell FC-B2V/FC55型),德国MMM集团公司产品;超声波细胞粉粹机(JY92-2D),宁波新芝生物科技股份有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 重组杆粒的构建及鉴定 将真核表达质粒pFastBac1-E2转化DH10Bac大肠埃希氏菌感受态,涂布于含50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL庆大霉素、10 μg/mL四环素、100 mg/L X-GAL、40 mg/L IPTG的LB平板,37℃条件下避光培养48 h;挑取白色菌落培养并进行测序测定。在上述含抗生素LB平板进行3轮划线培养,每轮均挑取白色菌落,将连续鉴定3次为阳性的重组杆粒命名为Bacmid-E2。

1.2.2 重组杆粒的病毒包装和传代 将Sf9昆虫细胞调整到对数生长期,细胞计数后按2×106个的密度铺于6孔细胞培养板中。细胞贴壁后按照FuGENE 6转染方法将Bacmid-E2转染至Sf9昆虫细胞。28℃条件下培养96 h,反复冻融收集上清记为第1代病毒(P1),按MOI=1传代接毒,第2代后每代培养72 h,传至第5代后,反复冻融收集上清为P5代毒作种毒,置-80℃保存备用。

1.2.3 E2蛋白的表达、纯化与鉴定 收集P1获得的细胞和培养基样本,分析目的蛋白的表达。将收集的细胞沉淀经超声处理后,上清液中加入上样缓冲液进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定和纯化测试。

1.2.4 间接ELISA抗体检测方法的优化 将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法作为基础,分别对影响间接 ELISA反应的各个因素进行方阵优化。抗原包被浓度(2、1、0.5、0.25 μg/mL);最佳封闭液(5%脱脂奶粉、1%明胶、10%山羊血清、10%马血清、1%BSA、10%兔血清);一抗稀释度(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800);二抗稀释度(1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000和1∶8 000);一抗孵育时间(室温0.5、1.0 h;37℃ 0.5、1.0 h);二抗孵育时间(室温0.5、1.0 h;37℃ 0.5、1.0 h);显色时间(10、20、30 min)。

1.2.5 间接ELISA方法的临界值确定 取51份经血清中和试验检测为BVDV抗体阴性的牛血清,用建立的间接ELISA方法检测,根据测定的OD450值计算平均值及标准偏差S,以(平均值+3SD)确定间接ELISA方法的临界值。

1.2.6 ELISA方法的特异性试验 用建立的ELISA方法分别对BVDV抗体阳性牛血清、IBRV抗体阳性牛血清、BPIV3抗体阳性牛血清、BRSV抗体阳性牛血清以及BVDV抗体阴性牛血清进行检测,根据OD450值判定有无交叉反应,以评价建立方法的特异性。

1.2.7 ELISA方法的敏感性试验 将BVDV阳性血清稀释至1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400倍,用建立的ELISA方法进行检测,以评估所建立方法的敏感性。

1.2.8 重复性试验 批内重复试验:使用同一批纯化的E2蛋白包被酶标板,检测5份不同抗体水平的BVDV阳性血清样品和1份BVDV阴性血清样品,确定变异系数。批间重复性试验:取3块不同时间包被在不同酶标板的试剂盒,检测5份不同抗体水平的BVDV阳性血清样品和1份BVDV阴性血清样品,统计并计算变异系数。

1.2.9 临床血清样品检测 应用建立的间接ELISA方法与经典的血清中和试验同时检测139份临床牛血清样品,比较检测结果并计算阴阳性符合率情况。

2 结果

2.1 重组杆粒Bacmid-E2转染Sf9细胞

将2 μg的重组杆粒Bacmid-E2转染正处于对数生长期的Sf9细胞,同时设置阴性Sf9细胞对照。培养96 h后在显微镜下观察发现,与阴性对照组相比,感染组细胞变大变圆,呈现半透明状态,部分细胞悬浮于培养液中。表明Bacmid-E2转染组细胞出现了病变。

2.2 P1代病毒表达测试结果

用标准方法制备重组Bacmid-E2,转染Sf9细胞生成P1病毒原液,收集P1获得的细胞并分析目的蛋白的表达。SDS-PAGE结果显示目的蛋白在45 ku左右出现明显条带,可溶性表达蛋白经纯化后效果较好(图1)。Western blot检测结果表明,重组E2蛋白能与BVDV阳性血清发生特异性反应(图2)。

M.蛋白标准;1.培养上清;2.Sf9细胞对照;3.细胞超声破碎离心后上清;4.细胞超声破碎离心后沉淀;5.纯化后的E2蛋白

2.3 间接ELISA方法的方阵优化结果

2.3.1 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定 由表1可以看出,抗原包被浓度为0.5 μg/mL 时,血清稀释倍数为1∶400时,P/N值最大,阳性血清OD450≥1.0且阴性血清OD450≤0.2,所以确定抗原包被浓度为0.5 μg/mL,血清稀释倍数为1∶400。

表1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度选择

2.3.2 封闭液的确定 选择封闭液为1%明胶于37℃封闭1 h,P/N值最大且阳性血清OD450≥1.0、阴性血清OD450≤0.2,确定其为最佳封闭液。

2.3.3 血清最佳作用方式的确定 加入1∶400稀释的血清后,置于室温和37℃分别作用30 min和60 min,结果显示血清于37℃作用30 min时,P/N值最大(17.1)且阳性血清OD450≥1.0、阴性血清OD450≤0.2,确定为血清的最佳最庸方式。

2.3.4 酶标二抗稀释度的确定 酶标二抗选择1∶2 000时,P/N值最大且阳性血清OD450≥1.0、阴性血清OD450≤0.2。

2.3.5 酶标二抗最佳作用方式的确定 加入1∶2 000稀释的酶标二抗后,置于室温和37℃分别作用30 min和60 min,结果显示酶标二抗于37℃作用30 min时,P/N值最大且阳性血清OD450≥1.0、阴性血清OD450≤0.2。

2.3.6 TMB底物反应时间的确定 底物作用时间为室温20 min时,阴阳性P/N值最大。

2.4 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定

对51份经血清中和试验检测为BVDV抗体阴性的牛血清进行检测(表2),测得 OD450平均值为 0.231,标准偏差SD为0.064,根据阴阳性临界判定规则(平均值+3SD),确定ELISA 方法的阴阳性临界值为 0.423,即样品OD450≥0.423时判定为阳性,样品 OD450为0.423时判定为阴性。

表2 51份BVDV抗体阴性牛血清OD450

2.5 特异性试验结果

通过间接ELISA方法检测,仅BVDV抗体阳性牛血清检测OD450大于0.423,其他均为阴性,说明建立的间接ELISA具有良好的特异性,与常见其它的牛血清无交叉反应。

2.6 敏感性试验结果

将BVDV阳性血清连续倍比稀释后,用建立的ELISA方法进行检测,结果显示,阳性血清稀释1 600倍时,OD450大于0.423仍为阳性,表明建立的ELISA方法具有较高的敏感性。

2.7 重复性试验结果

表3和表4结果显示,板内重复性试验变异系数小于8.29%,批间重复性试验变异系数小于8.85%,均小于10%,表明建立的ELISA方法重复性良好。

表3 批内重复性试验

表4 批间重复性试验

2.8 与血清中和试验的比对试验

用建立间接ELISA方法与血清中和试验同时检测139份临床牛血清样品,对检测结果进行统计学分析。血清中和试验检测到阳性样本61份、阴性样本78份;建立的间接ELISA方法检测到阳性样本64份、阴性样本75份。结果显示,两种检测方法的阴、阳性符合率分别为96.2%和95.3%,总体符合率为97.8%。

3 讨论

BVD目前尚无特效药物防治,国内外主要采取疫苗免疫、病原和抗体检测、清除持续性感染牛、种群净化等综合措施,因此BVDV抗体监测和疫苗效果评价非常重要[8-9]。血清抗体间接ELISA检测方法对人员、设备要求较低,检测速度快、结果判定简单且敏感性高于中和试验,在临床样本检测和疫苗免疫抗体监测等方面具有重要价值,适用于大面积推广应用[10]。本研究通过真核表达的E2蛋白来建立间接ELISA抗体检测方法,其特异性强、敏感性高,可较为客观的评价血清的BVDV抗体和免疫动物的抗体水平,对大批量临床样本的抗体检测、基层样本筛查以及BVDV净化等方面具有重要的价值。

建立稳定的间接ELISA抗体检测方法的关键是表达和纯化出具备天然结构的包被蛋白,常用的目的蛋白表达体系有原核表达系统和真核表达系统[11-13],原核表达系统操作简单,蛋白含量较高,但是表达出的蛋白不具有天然结构,导致抗原与血清抗体的匹配性出现差异,很容易造成检测敏感性不高或出现假阳性的现象。真核表达系统其表达产物具有正确的折叠构象和糖基化、磷酸化等翻译后的修饰,因此其表达的蛋白更接近于病毒的天然结构。E2蛋白是BVDV的主要抗原蛋白,是病毒粒子中具有最高免疫原性的蛋白,也是BVDV的毒力决定因子,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统成功制备出了更接近病毒天然结构的重组E2蛋白,为开发商品化试剂盒奠定了基础。

目前国内BVDV抗体检测使用的ELISA试剂盒大多为国外进口,价格昂贵,检测成本高,给基层疫病防控带来较大困难。本研究建立的间接ELISA抗体检测方法,与传统的血清中和试验相比,符合率高达97.8%,在保证检测方法特异性的同时,检测的敏感性比血清中和试验更高,可进一步完善为成熟产品,具有良好的应用前景。