基于能力验证活动对玉米真菌毒素快检技术的评价

钱承敬，张巍巍，史晓梅，翟 晨，邹 雷，马同超

（中粮营养健康研究院；营养健康与食品安全北京市重点实验室1，北京 102209）

（中粮贸易有限公司2，北京 100005）

玉米是我国重要的主粮作物之一，在我国粮食生产及消费中占有重要地位。我国玉米约70%作为饲用原料，通过养殖业间接进入肉用食品领域。作为主要的饲料原料［1］，玉米在养殖业中占有不可或缺的地位。随着市场对生化能源产品和粮食生物化工的需求增加，工业市场对玉米的需求也逐渐增加。2021 年全年玉米总消费量达到3.0 亿t，但国内玉米种植收获仅能自给自足2.7 亿t。供需缺口仍达到3 000万t。同时近年来东北玉米真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）污染逐年升高［2，3］，2019 年玉米中DON 检出率为98.35%，超标率为0.00%。2020 年检出率为99.51%，超标率为8.64%。2019 年玉米中ZEN 的检出率为90.08%，超标率为6.94%，2020 年的检出率分别为95.31%，超标率为7.90%。依据GB 13078《饲料卫生标准》玉米原粮中DON限量为5 mg／kg，但实际饲料生产过程中玉米为主要原料通常质量分数会占60% ～70%，为了保证饲料成品毒素符合限量要求，采购限量通常控制玉米中DON≤1 mg／kg，ZEN≤0.15 mg／kg［4］。同时肉猪养殖行业持续需求低毒素玉米（呕吐毒素＜500 μg／kg）以供应妊娠母猪及教保料饲料使用。全国每年低毒素玉米需求达到900万t 以上［5］。随着玉米毒素的升高和养殖需求的不断扩大，毒素指标作为关键卫生指标成为制约玉米饲用销量与价格的主要因素［6］。

目前，原粮贸易过程中生物毒素的现场检测通常采用免疫分析的快检技术［7］。待测样品经过研磨粉碎，提取其中的待测物，通过酶联免疫吸附法（ELISA）［8］、胶体金免疫层析等技术检测待测物浓度［9］。快检技术已经广泛应用于原粮交易领域［10］，但由于我国对快检试剂的管理还处于初级发展阶段，快检产品在市场上仍然品牌众多、质量参差不齐。国家监管部门先后发布了食品快检试剂评价的标准或规范，以评价机制促使市场的优胜劣汰，提高产品质量，保证行业良性发展。2017 年，原国家食品药品监督管理总局发布规定，严格把控快检产品性能要求，在快检产品采购前和使用中须进行评价，确保产品满足需求。原国家食品药品监督管理总局发布的《食品快速检测方法评价技术规范》作为食品快检的纲领性文件，对食品快速检测方法的目的、适用范围、评价指标、评价方法、评价步骤、评价结果及报告出具等列出了指导原则，但是缺乏针对不同类型快检产品的操作指南［11］，同时快检技术本身测量精度有限，因此在实际操作过程中仍难以准确评价不同快检产品的优劣［12］。

能力验证是指利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力。是实验室判断检测技术是否存在问题的重要技术手段［13］。因此，为了解原粮收储、贸易行业真菌毒素快速检验技术的实际使用情况［14］，本研究通过研制玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮质量控制样品［15］，排除玉米毒素分布不均匀的影响。组织实施原粮收储企业真菌毒素快速检测能力验证，并对此次能力验证活动结果分析汇总，以期综合评价快检实际使用情况，推动快检技术提升，为原粮贸易过程中关键卫生指标检测提供有效的技术支持及参考［16］。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

JXFM110 锤式旋风磨，RetschAS200 分级振筛，DHG－9108A 鼓风干燥箱，ZC －390 型真空封口机，Qtrap5500 三重四级杆质谱仪，ShiseidoC18 色谱柱（2.1 mm ×100 mm，3 μm），HITACHICR21GⅢ高速冷冻离心机，免疫亲和柱Romer。

实验玉米样品：采用东北玉米主产区21／22 产季玉米样品，经高效液相串联质谱法检测其中DON、ZEN含量，选用DON 超过1 000 μg／kg，ZEN 超过150 μg／kg样品用于能力验证样品的制备。

乙腈、甲酸、甲醇，色谱纯；甲酸，分析纯。提取液：乙腈／水／甲酸溶液（体积比为80 ∶18 ∶2）；复溶液∶甲醇／水／甲酸溶液（体积比为30∶70∶0.1）；乙腈／水溶液（体积比为80 ∶20）。毒素外标标准溶液：DON、ZEN，市售有证标准物质。毒素外标同位素内标：［13C15］－ DON：10 μg／mL，［13C20］－ ZEN：10 μg／mL，市售。

1.2 样品制备

将天然污染的玉米籽粒样品15 kg，采用锤式旋风磨研磨，样品全部通过80 目筛板，得到玉米粉。采用分级振筛将研磨后的样品全部通过80 目筛网。过筛后的玉米粉采用鼓风干燥箱105 ℃温度烘干1 h。样品烘干后冷却至室温，采用饲料搅拌机在100 r／min下连续搅拌12 h。为保证样品长期实验期间储存稳定性，依据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》直接干燥法［17］测定样品水质量分数为7%。水质量分数远低于原粮安全仓储14%，因此在避光的室温条件下应符合长期保存要求［18］。

将玉米粉样品称量分装至铝箔袋，规格20 g／袋，共计制备样品500 袋。采用真空封口机，抽真空密封样品。样品储藏在阴凉避光的室温条件下。

1.3 样品测定

1.3.1 方法原理

样品中的DON、ZEN毒素经酸化乙腈萃取，提取液经免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后经液质联用仪测定，同位素内标峰面积法定量［19］。

1.3.2 实验方法

称取2 g（精确到0.01 g）样品到50 mL 离心管中。加入100 μL混合内标标准溶液，加入9.9 mL提取液。涡旋1 min混合均匀，超声提取20 min。4 ℃，8 000 r／min离心10 min，将5 mL上清液转移至另一洁净离心管中（5 mL），涡旋混匀1 min。事先将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。准确移取5 mL上清液，于40 ～50 ℃下氮气吹干，加入2 mL水充分溶解残渣，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至玻璃注射器筒中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节下滴速度，控制样液以1 滴／s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5 mL PBS缓冲盐溶液和5 mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1 ～2 滴／s，直至空气进入亲和注中，弃去全部流出液，抽干小柱［20］。准确加入2 mL甲醇洗脱亲和柱，控制下滴速度为1 滴／s，收集全部洗脱液至试管中，在50 ℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0 mL初始流动相，涡旋30 s 溶解残留物，0.22 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样［21］。

1.3.3 仪器参数与测定条件

色谱条件：色谱柱使用Shiseido－C18（100 mm×2.0 mm，3 μm），0.3 mL／min 流速，进样体积20 μL；流动相：A相为0.1%（体积分数）甲酸／水溶液，B 相为0.1%（体积分数）甲酸／甲醇溶液，梯度洗脱的体积比见表1。

表1 液相色谱的梯度洗脱条件

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），离子源温度：550 ℃；离子喷雾电压：5 500 V（正模式）／ －4 500 V（负模式）；气帘气压为35 psi；气体1 气压为50 psi；气体2 气压为55 psi；采用多反应监测（MRM）模式进行检测，质谱参数见表2。

表2 2 种目标化合物特征离子质谱分析参数

表3 进样次序

仪器测定：对稀释好的标准工作溶液和处理好的样品溶液按表2 的顺序进样测定。

1.3.4 计算公式

样品中目标化合物含量的计算见式（1）。

式中：Xi为样品中目标化合物的含量／μg／kg；Ci为从标准曲线所得测定液中待测物的质量浓度／μg／L；V为试样的定容体积／mL；m 为试样的称样质量／g；2 为浓缩倍数。

1.3.5 均匀性与稳定性检验

样品的均匀性检验依据计量规范JJF 13432—022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》采用抽取25 个分装好的样品分别检测DON、ZEN 含量，通过方差分析的统计方法，95%置信区间内F 值小于临界值确定瓶内均匀性与瓶间均匀性符合要求。

样品稳定性检验依据CNAS －GL003：2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》，分别评价能力验证周期内长期稳定性、60 ℃与－20 ℃短期稳定性及模拟运输条件稳定性，确保能力验证周期内稳定性不会对样品量值产生影响。

2 能力验证实施

2.1 样品发放

本次能力验证活动共153 家企业质检实验室参与，于2022 年3 月成立能力验证项目组，开始方案规划。4 月开展样品制备及均匀性、稳定性检验，并邀请企业报名参加。于4 月15 日发送能力验证样品，样品均采用快递投递，邮寄真空铝箔纸包装玉米粉样品1 份。样品常温运输，常温保存。随样品发放作业指导书1 份。6 月30 日完成结果统计及技术报告撰写完成，并发布结果通知单。

2.2 结果评价

依据能力验证检测项目性质及参加实验室数量，参考GB／T 28043—2019 利用实验室间比对进行能力验证的统计方法［22］，本次能力验证活动采用采用稳健统计技术处理检测结果和评价结果。统计分析是建立在实验结果服从近似正态分布，分布是单峰尽可能对称的基础上进行的。通过专家评议识别出明显异常数据后，采用中位值和标准化四分位距法计算得到中位值和标准化四分位距［23］。

Z值计算方法见式（2）。

式中：x为参加者检测／校准结果；X为指定值；σ为能力评定标准差。

以下列准则评定参加者的结果：｜Z｜≤2.0 为满意结果；2.0 ＜｜Z｜＜3.0为可疑结果，警告信号；｜Z｜≥3.0为不满意结果（离群值），行动信号。

2.3 参加者分布

本次能力验证活动参加者共计153 家，其中仓储粮库占36%、饲料养殖企业占64%。参加实验室遍布17 个省、市、自治区（表4）。均为原粮贸易行业质量检测实验室。

表4 参加者分布

2.4 能力验证结果

各实验室反馈数据汇总绘制数据分布图，如图1和图2 所示，实验结果服从近似正态分布，分布为单峰且近似对称。适用于采用稳健统计分析。脱氧雪腐镰刀菌烯醇分析数据中部分结果远小于其余数据，小于平均值的1%，判定为粗大误差，结果予以剔除。玉米赤霉烯酮分析数据中经格拉布斯统计检验剔除异常数据。剔除异常数据后，通过中位值和标准化四分位距统计方法计算得到中位值和标准化四分位距，得到总体均值和总体标准差的估计值。经计算评价指定值不确定度ux＜0.3σ，故结果评价时，指定值的不确定度可以忽略，因此采用Z 统计量评价能力验证结果。

图1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇数据分布

图2 玉米赤霉烯酮数据分布

本次能力验证计划报名参加153 家实验室，其中148 家实验室报送呕吐毒素检测数据（定性检测2家实验室），142 家实验室报送玉米赤霉烯酮毒素检测数据结果（定性检测25 家实验室）。其中全部定性结果均与Z ＜2 子集重叠，因此不适宜于本次能力验证评价。其中DON 检测，满意132 家，84.6%；可疑9 家，5. 8%；不满意5 家，3. 2%；不适宜评价，2家，1.3%。ZEN 检测，满意100 家，64.1%；可疑，13家，8.3%；不满意，4 家，2.6%；不适宜评价，25 家，16.0%。能力验证统计量如表5。

表5 能力验证统计量

2.5 调研信息反馈

为综合了解毒素快速检测使用情况，本次能力验证活动同时向各参加实验室发出调研问卷。其中包含日常检测频率、单次检测成本、快检设备采用的技术类型等问题。共计148 家企业原粮检验实验室回复信息，以便参加实验室更全面的了解行业整体情况。

统计行业毒素快检检测成本的差异，通过调查问卷中单次检测成本从10 元／次至高于120 元／次设定了不同的区间，根据反馈的数据，其中27.6%的企业采购快检的单次检测成本均为20 ～30 元。为了解部分企业成本偏高的原因，随机对3 ～5 个企业回访沟通。总结原因主要有两方面，一是检测频率过低，单次采购的试剂药品因过期而无法使用，造成平均成本较高；二是为保证数据准确性，采购进口快检产品。统计结果见图3。

图3 单次快检测试成品分布

因为粮食污染地域性分布差异较大，所以在不同区域为了平衡质量风险与检测成本通常会根据实际情况确定检测频率。为了了解行业实际毒素检测频率，能力验证过程中也要求各单位报送日常检测频率信息。图4 可见，收储过程中每车样品均采样检测毒素的企业占绝大多数，比例达到50%。同时基于统计数据，其中检测频率达到每车检测的收储粮库比例为31%，饲料养殖企业比例为59%。因此玉米收储、销售领域的企业均非常重视毒素检测的结果，养殖饲料企业重视程度更高。

图4 粮食毒素检测频率分布

本次能力验证反馈数据均采用食品安全快检技术，其中大部分企业采用胶体金检测技术占总体数据的66%，荧光定量技术占24%，酶联免疫技术占10%。一定程度上反应了仓储、饲料、养殖行业快检技术应用状况。

2.6 可能影响检测结果的原因

本次能力验证活动要求实验室采用日常检测使用的检测方法，操作人员应当对所采用的检测技术、方法有一定的了解。同时不限制快检仪器的品牌及型号，而且快检技术本身测试精度通常低于实验室标准方法，因此个别实验室出现了不满意或可疑的结果，仅代表测量结果偏差于参加实验室的平均水平，是否需要纠偏行动，还需要实验室自身评价是否能满足日常生产需求。因此实验室对毒素快检技术应有一定了解。产生偏差的可能原因是其中2 家实验室采用液相检测方法，其余实验室均采用快速检测方法测定并报送数据。通过与不合格实验室沟通了解，可能出现偏差的原因是部分企业检测频率较低，一次采购试剂耗材长期用不完，或储存不当，造成试剂变质过期，导致检测结果不准确；操作人员培训不到位，操作不规范，造成结果偏差；实验室环境控制条件相对较差，温、湿度不稳定超过实验要求的范围，造成偏差；称量设备、液体移取设备为校准，产生误差。

3 结论

本次能力验证活动的实施，通过质控样品的研制，排除真菌毒素分布不均匀导致的采样误差，客观评价了企业毒素快检技术使用情况。活动共计153家企业质检实验室参加，采用稳健统计技术处理检测结果和评价结果。其中DON 检测，满意132 家，84.6%；可疑9 家，5.8%；不满意5 家，3.2%；不适宜评价，2 家，1.3%。ZEN 检测，满意100 家，64.1%；可疑，13 家，8. 3%；不满意，4 家，2. 6%；不适宜评价，25 家，16.0%。能力验证测试中统计变异系数CV值为DON 26%，ZEN 29%。统计结果一定程度上反映了粮食贸易行业上下游企业的真菌毒素快速检测能力。对检验人员而言，能力验证活动是积累经验及能力提升的过程。通过参加能力验证，可以有效提高实验室质量管理水平和检验检测能力，对实验室的能力建设和服务地方经济水平具有积极作用，同时，综合评价研究结果可以作为粮食安全、食品安全监管部门提供现有情况的数据支持，并对参加实验室提供相对客观的检测能力评价，为提升检测能力、保障源头食品安全管控提供技术参考。