酸性调控对大豆分离蛋白纤维功能性质的影响

高喧翔，梅馨澜，朱泽丹，陈鸿杰，樊继开，杨素华，刘玲玲，班兆军

（浙江科技学院生物与化学工程学院；浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室；浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，杭州 310023）

蛋白质自组装纤维已经吸引了各研究领域的关注，如纳米技术、食品、电子、医药和软物质科学［1］。蛋白纤维的形成一般是在酸性环境下进行热处理而引起的。在加热过程中，蛋白质会展开、水解，然后自我组装成纤维状聚集体［2］，如乳清蛋白［3］、溶菌酶［4］、β－乳球蛋白［5］等均可在一定条件下，形成直径约为2 ～8 nm，长度为20 ～30 μm的蛋白纤维。

在食品科学领域，蛋白纤维化主要作为改善蛋白功能性质的一种方法［6］。蛋白质经纤维化改变后，表面会呈现出多种反应性官能团，这使得它们被赋予新的功能特性。蛋白纤维会导致表观黏度的显著增加，形成黏性黏弹性界面，从而带来高泡沫和乳液稳定性［7］。在极低浓度下，纤维蛋白可以产生冷凝凝胶，这被归因于空间填充网络的形成［8］。除此之外，蛋白纤维还具有增强聚合物膜，作为输送载体以及在制造生物传感器和生物吸附剂（主要作为支架）的应用［9］。然而，蛋白质纤维化进程是极其复杂的，受诸多因素影响，如体系温度、盐离子、不良溶剂等，人们对蛋白纤维的调控手段及稳定机理还知之甚少。

酸诱导剂会影响自组装纤维化进程，不同强度的酸溶剂电解能力不同，由此诱导的蛋白纤维中氢键浓度也不同。因此，为了更清楚地认识蛋白质纤维化组装规律，本研究选择用醋酸和盐酸对SPI进行纤维化处理，然后探究不同SPI 自组装纤维的结构、乳化特性、凝胶特性及成膜性质，以实现蛋白纤维的可控化制备。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

根据碱溶酸沉法实验室自制大豆分离蛋白，蛋白质质量分数为（94.30 ±1.54）%；冰醋酸、盐酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HCJ－4G磁力搅拌水浴锅，Zetasizer Nano 纳米粒度仪，Mastersizer 3000 粒度分布仪，Multimode SPM原子力显微镜，Chirascan 圆二色谱仪，日立F －4500荧光分光光度计，TA－XT2i质构仪。

1.3 实验方法

1.3.1 SPI纤维化溶液制备与性质表征

用一定浓度的HCl溶液和醋酸溶液将SPI 粉末溶解，调节pH至2.0，配制成质量浓度为60 mg／mL溶液；放入水浴锅加热5 h，期间每隔15 min进行1 次验调，得到由盐酸诱导形成的SPI 纤维（H －SPI）和由醋酸诱导形成的SPI纤维（C－SPI）；另取SPI粉末溶于PBS溶液（pH ＝7.0，5 mmol／L）配制成质量浓度为60 mg／mL的蛋白溶液，放入水浴锅加热5 h，作为对照样品（N－SPI）。

二级结构测定：使用圆二色谱仪在190 ～260 nm之间进行扫描，测量质量浓度为0.2 mg／mL，扫描速度20 nm／min，带宽1 nm。二级结构含量的分析和计算根据在线网站http：／ ／ dichroweb. cryst. bbk. ac. uk获得。

粒度测定：采用马尔文粒度分析仪测定LYZ 的平均粒径和粒度分布。将A －LYZ 溶液用醋酸溶液（pH ＝2.0）稀释至0.5 mg／mL。O － LYZ 溶液用0.01mol／L的PBS缓冲溶液（pH ＝7.0）进行稀释。

微观形态：LYZ 经过纤维化前后的颗粒形貌通过原子力显微镜（AFM）观察得到。A －LYZ 溶液用醋酸溶液（pH ＝2.0）稀释至25 μg／mL，O－LYZ溶液用去离子水稀释。取20 μL稀释后的溶液滴加在新鲜剥离的云母片表面，等待自然风干。在轻敲模式下进行测量，AFM观测到的图像用NanoScope Analysis 1.9 软件进行图像处理和分析。

硫黄素（ThT）荧光分析：实验方法参考朱连昌［7］。使用10 mmol／L、pH ＝7.0 的磷酸盐缓冲溶配置质量浓度为0.016 mg／mL 的ThT 工作液。取5 mL工作液与30 μL样品混合均匀，测定混合液荧光强度。测定条件设为激发波长460 nm，发射波长490 nm，狭缝间隙5 nm，电压700 mV，扫描范围为470 ～600 nm。

1.3.2 凝胶的制备与性质测定

将制备N－SPI、H －SPI、C －SPI 溶液中的蛋白质量浓度提高至100 mg／mL，并将样品于4 ℃静置24 h，得到N－SPI、H－SPI、C－SPI凝胶。

采用质构仪测定蛋白凝胶的凝胶硬度。在室温下，选取P5 探头（直径5.0 mm），输入测前速度为2.0 mm／s，测中速度为1.0 mm／s，测后速度为3.0 mm／s，触变力为3.0 g，压缩的变形量为50%。

1.3.3 乳液的制备及性质测定

向N－SPI、H －SPI、C －SPI 溶液中缓慢地加入不同油相比的食用油（油体积分数φ ＝0.2、0.4、0.6），用均质机在10 000 r／min转速下均质3 min，得到N－SPI、H－SPI、C－SPI乳液。

乳液的微观形态采用光学显微镜观察。乳液的粒径利用Mastersizer 3000 粒度分布仪测定。分散剂为去离子水，乳液的相对折射率为1.470，分散剂折射率为1.330。

脂肪上浮率（CI）：取10 mL新制乳液于小瓶中，在室温下放置，并记录不同时间下层清液的高度（HS）和总高度（HT）。

1.3.4 膜的制备及性质测定

分别取10 mL N －SPI、H －SPI、C －SPI溶液，各加入0.2 g甘油，搅拌均匀后采用流延法于聚四氟乙烯平皿中制备薄膜，室温下干燥后揭膜，置于RH＝40%干燥器保存待用。膜的厚度选取薄膜的5 个点进行测量，计算平均值，精确至0.001 mm。

机械性能：薄膜机械性能主要测定抗拉强度（TS）和断裂伸长率（E）。将薄膜裁剪成2 cm×6 cm的规格，用夹具固定进行测量，初始夹距30 mm，拉伸速度50 mm／min［10］。

水蒸气透过率：水蒸气透过率（WVP）和水溶性（WS）的测定见文献［11］。干燥器内放入BaCl2饱和溶液使其湿度保持在90%。选择敞口玻璃容器放入烘干至恒重的CaCl2并将裁剪的薄膜覆盖在玻璃容器表面，用矿脂密封后置于干燥器中，每隔一段时间称量玻璃容器的质量，并按式（2）计算薄膜的WVP。

式中：WVP为湿系数／g·mm／（m·d·Pa）；Δm为t时间内质量增量／g；X为膜的厚度／mm；A为透湿杯的有效测定面积／m2；t为时间间隔／h。

水溶性：将薄膜裁剪成2 cm ×2 cm 的规格，在105 ℃下干燥至恒重m1。加入50 mL去离子水在室温下溶解24 h，将水倒掉，干燥至恒重为m2，根据质量变化计算薄膜的水溶性。

式中：m1为第1 次干燥至恒重时薄膜的质量／g；m2为第2 次干燥至恒重时薄膜的质量／g。

1.3.5 数据统计分析

使用Origin 2020b软件、Excel软件和SPSS对数据进行分析处理。

2 结果与讨论

2.1 蛋白纤维化

SPI纤维化反应前后的粒度分布和平均粒径如图1 所示。原始SPI（N－SPI）的粒径成单峰分布，平均粒径约为（24 ±1.5）nm，与之前的报道相符［12］。经盐酸诱导的蛋白溶液（H －SPI）体积分布较N －SPI粒径显著增大，且呈双峰分布，峰值分别在（35 ±5.3）、（719.3 ±37.9）nm 处。说明盐酸诱导的SPI在85 ℃热处理过程中发生聚集而形成较大颗粒。相较于H－SPI，经醋酸诱导的蛋白溶液（C －SPI）粒径进一步增大，平均粒径增大至（1 431. 6 ±56. 5）nm，这是由于蛋白质单体在疏水作用和静电斥力作用下发生纤维化转变的结果［13］。

图1 3 种蛋白溶液的粒径分布图和平均粒径

SPI经纤维化处理后的微观形态如图2 所示。N－SPI为20 ～240 nm 的球形颗粒，分散性良好，与粒径分布结果一致。H－SPI外观呈长而细，无分支，部分弯曲状态，长度为450 ～920 nm。在Xiang等［14］的研究中也发现了大豆分离蛋白进行纤维化处理后出现了蠕虫样的原纤维以扭曲的形式存在。C －SPI呈蠕虫样的卷曲状，长度约为700 ～1 500 nm。盐酸和醋酸诱导出不同淀粉样纤维的原因可能与两者氢离子浓度不同相关，同一pH 下，醋酸溶液电离出的氢离子浓度更高，蛋白纤维中氢键浓度也更高，其诱导形成的蛋白纤维更加绵长。

图2 原子力显微镜2D和3D成像图

蛋白质纤维化往往伴随分子构象的转变，特别是β －折叠结构的形成［15］。ThT能平行插入β －折叠结构并与其结合，导致蛋白最大荧光强度显著增大，可利用该原理检测蛋白质纤维化反应动力学，并以此判断蛋白纤维形成［16］。如图3a 所示，N － SPI具有较低的ThT 荧光强度（～1 932）。随着纤维化时间的延长，H －SPI 的ThT 最大荧光强度由1 932增加至3 853，C－SPI增加至4 711，至5 h 以后保持平稳，这说明经纤维化处理，大豆蛋白β －折叠结构总量大大增加且纤维化的最优时间为5 h。之后，进一步利用CD 判断SPI 经纤维化处理前后二级结构的变化情况，如图3b所示，N－SPI在208 nm处具有明显的负平均残基椭圆率，表明原始SPI以α －螺旋为主。SPI经盐酸纤维化处理后，波长从208 nm 移到203 nm，同时最大负平均残基椭圆率增加。而SPI经醋酸处理后的最大负平均残基椭圆率进一步增大，表明形成了更多的β －折叠结构。由BeStSel 软件计算可知，H－SPI和C－SPI的β －折叠质量分数由34.50%分别提高到40.80%和42.40%。

图3 蛋白在热处理过程中的Th T最大荧光强度和蛋白溶液的远紫外光谱

2.2 凝胶特性

蛋白纤维化最明显的特征就是β －折叠结构明显增多，而富含β－折叠结构的材料通常具有独特的高比表面积和机械强度，从而表现出较好的胶凝和成膜能力［17］。如图4 所示，N －SPI、H －SPI、C －SPI的凝胶硬度分别为181.94、234.64、399.31 g。相比之下，颗粒型蛋白凝胶的硬度远远低于纤维型蛋白凝胶，而由醋酸调配的纤维型蛋白凝胶的硬度更是高于由盐酸调配的纤维型蛋白凝胶。凝胶的持水能力则体现了蛋白质分子与水分子间的氢键相互作用，通常两者作用力越强，蛋白的持水能力越强［18］。由图4 可知C－SPI型凝胶蛋白分子与水的结合能力最强，这说明醋酸诱导的蛋白纤维化表面拥有更多的氢键位点。

图4 3 种蛋白凝胶的凝胶硬度和持水能力

2.3 成膜性质

3 种蛋白的成膜能力则是通过测定其膜的机械性能和屏障性能表示。TS 和E 分别反映了薄膜的变形抗力和韧性［19］。如表1 所示，纤维化处理对N－SPI薄膜的TS和E影响较为显著，尤其是C－SPI的E值，比N－SPI提高7.1 倍。主要的原因是在酸热处理过程中，蛋白质的β－折叠结构及氢键浓度的增加，由此形成坚固致密的网状结构，从而得到具有一定机械强度和柔韧性兼具的薄膜［20］。蛋白薄膜的WVP和WS则反应了蛋白薄膜的屏障性能，如表1所示。与N－SPI 薄膜相比，纤维化薄膜的WVP 和WS均有明显的下降，说明纤维化后薄膜拥有更强的阻水性能，这在一定程度上反映了纤维化薄膜网状结构的致密性，纤维化薄膜更能有效地隔绝水分［21］。

表1 薄膜的机械性能、水蒸气透过率和水溶性

2.4 乳化性质

纤维化是蛋白质结构展开再折叠的过程，该过程结束后，蛋白质的柔顺性会发生巨大改变［22］。据报道，蛋白质的柔顺性与其乳化性密切相关［23］。以C－SPI和H －SPI与N －SPI为乳化稳定剂，制备水包油乳液，并对比研究三者的乳化性质。在c和φ相同的条件下，蛋白的乳化活性可以由乳液平均粒径反映。由图5 所示，而相同的浓度和油相比的条件下，颗粒型蛋白乳液平均粒径远大于纤维型蛋白乳液平均粒径，其中由醋酸调配的纤维型蛋白乳液的平均粒径要低于由盐酸调配的纤维型蛋白乳液。当油相比增大时，乳液的粒径不断增大。这是因为油滴浓度的增大，稳定乳化界面的乳化剂越少，导致油滴间产生相互作用的概率增大，在疏水相互作用下形成粒径更大的油滴［24］。图6 为该场合下，不同油相比的3 种蛋白乳液稀释后的显微镜照片，C －SPI乳液的粒径随着油滴浓度的增大，粒径增大幅度较小，这可能与C－SPI的结构柔顺性有关。蛋白柔顺性越高，吸附在油水界面的稳定性越高，那么其稳定乳液界面的能力就越强。

图5 3 种蛋白乳液在不同油相比中的平均粒径（c ＝1 mg／100 mL）

乳液油滴之间互相絮凝、结合产生新的更大的油滴聚合体，因为油和水密度的不同，会迅速形成分层，也就是脂肪上浮现象［25］。图7 是质量浓度为1 mg／100 mL的N－SPI、H－SPI、C －SPI型乳液在室温下静置14 d过程中脂肪上浮的情况。3 种乳液均在3 d内达到最大脂肪上浮率，且其脂肪上浮率随φ的增大而减小，纤维化乳液的脂肪上浮率略小于颗粒型乳液，而C －SPI 乳液的稳定性略优于H －SPI乳液。造成以上差异的原因可能是纤维化蛋白富含β－折叠结构而表现出更高的表面疏水性，更易在油水界面形三维网络，当形成的网状结构速度大于脂肪上浮的速度时，就会一定程度上抑制脂肪上浮，由此可见，SPI纤维化程度越高，乳液的脂肪上浮稳定性越高［7］。

图7 3 种蛋白乳液在不同油相比下的脂肪上浮情况

3 结论

以SPI 和由盐酸和醋酸诱导的SPI 纤维为研究对象，对比研究其结构特征、乳化特性、凝胶特性及成膜性质的差异。AFM、CD等实验分析表明在酸热处理下淀粉样原纤维的形成，并且由醋酸诱导的纤维化蛋白β－折叠结构比例最高。纤维化处理不仅提高了SPI的凝胶硬度与持水性，并显著改善了SPI薄膜的机械性能和阻隔性能，尤其是C －SPI型薄膜对SPI 薄膜柔韧性的改变显著。在质量浓度为1 mg／100 mL条件下，蛋白纤维稳定的乳液具有更优的乳化活性和脂肪上浮稳定性，且稳定程度与纤维化程度呈正相关。因此，可通过选择合适的酸诱导剂种类，调控蛋白的纤维化程度，实现蛋白纤维材料功能特性的优化，为基于蛋白纤维的新型纳米材料的研发提供参考。