国槐枝枯病病原菌鉴定及其生物学特性

罗芷涵,刘朋飞,于 军, 齐 鹤, 陈小光,楼兵干,*

(1.浙江大学 生物技术研究所,农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室,浙江 杭州 310058; 2.塔里木大学 植物科学学院,新疆 阿拉尔 843399; 3.巴音郭楞蒙古自治州林业和草原局,新疆 库尔勒 841000; 4.库尔勒市园林局,新疆 库尔勒 841000)

国槐[Styphnolobiumjaponicum(L.) Schott]是蝶形花科(Fabaceae)的一种落叶乔木,是常用的园林绿化树种,也是经济林兼用树种。该树原产于我国北方,现今在我国大部分地区均有分布,是北京、石家庄、大同、西安、兰州等城市的市树[1],也是新疆,尤其是南疆,如库尔勒、焉耆、博湖、阿克苏、阿拉尔等地的主要绿化树种。

近年来,在新疆的库尔勒市、阿克苏市、阿拉尔市等多地的绿化、行道国槐上发生一种新病害——国槐枝枯病,其株发病率高达50%～70%。由于病树多、病情严重,大量国槐树出现枝条枯死,甚至全株枯死的现象,当地相当数量的国槐已无法发挥行道遮蔽、水土保持、防沙固沙等多方面的作用,该病害已严重影响到南疆的城市绿化。因此,明确造成国槐枝枯病的病因、找到防控措施迫在眉睫。查询国内外相关文献,未见任何类似病害的描述与报道。为了明确引起南疆国槐枝枯病的病原菌,更好地指导病害的防控工作,本文着重就新疆地区国槐枝枯病的症状、病原鉴定及病原菌的生物学特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2019—2022年连续在库尔勒、阿克苏、阿拉尔等地采集具有发黄枯死等症状的国槐枝条,装入干净样本袋中,带回实验室进行病原菌分离。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基):去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1 L。改良营养琼脂培养基(NA培养基):蛋白胨10 g,蔗糖30 g,NaCl 5 g,琼脂15 g,蒸馏水1 L。甘薯葡萄糖琼脂培养基(SPDA培养基):甘薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂15 g,蒸馏水 1 L。玉米粒琼脂培养基(CMA培养基):玉米粒60 g,葡萄糖20 g,琼脂15 g,蒸馏水1 L。固体查氏培养基(Czapek培养基):MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41 g,KCl 0.5 g,NaNO32 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,蔗糖25 g,琼脂 20 g,蒸馏水 1 L。燕麦片琼脂培养基(OA培养基):燕麦片 30 g,琼脂 15 g,蒸馏水1 L。水琼脂培养基(WA培养基):琼脂粉15 g,蒸馏水1 L。基本培养基(CM培养基):NaNO36 g,KCl 0.52 g,MgSO4·7H2O 0.52 g,KH2PO41.52 g,葡萄糖 10 g,蛋白胨2 g,酵母提取物1 g,酪蛋白氨基酸1 g,1 000×微量元素 1 mL,1 000×维生素1 mL,蒸馏水 1 L,具体配制方法参考《植病研究方法》[2]。

1.3 国槐枝枯病的病害调查

从2019年到2022年,在每年的春季、夏季、秋季对库尔勒市、博湖县、焉耆县和阿克苏市、阿拉尔市的国槐枝枯病的危害症状、株发病率进行观察与调查,拍照记录病害症状,并计算株发病率。

1.4 病原菌的分离与纯化

采用组织分离法,用灭菌解剖刀剪取具有典型症状的国槐枝条病健交界处,使用75%乙醇消毒30 s、1%次氯酸钠消毒5 min后用无菌水冲洗晾干,用无菌刀片切成5 mm×5 mm的小块,在每个PDA平板上均匀放置3块,置于28 ℃恒温生化培养箱中培养,待长出菌落后,挑取菌落边缘进行多次纯化,直到菌落形态完全一致。纯化的菌落转入PDA培养基斜面上,4 ℃保存。采用真菌单孢分离法,采集肉眼可见黑色分生孢子的病枝条,按上述方法冲洗晾干后,用无菌水将枝条上的分生孢子冲洗到灭菌三角瓶中,不断稀释孢子悬浮液直至浓度为每10 μL一个孢子。将悬浮液均匀涂布在PDA培养基上进行培养,待生长出单一菌落后,挑取菌落进行多次纯化,并保存。

1.5 病原菌致病性测定

通过上述方法分离得到GH01、GH02、GH03、GH04、GH05、GH06、GH07、GH08、 GH09、 GH10、 GH11、 GH12、 GH13、 GH14、 GH15和 GH16等16株菌,选择代表性菌株GH01进行致病性测定。将菌株GH01在PDA培养基上培养3 d,用打孔器(直径5 mm)在菌落边缘打出菌饼,用灭菌手术刀在国槐当年生嫩枝上划一小伤口,将菌丝面朝内贴到伤口处,用保鲜膜固定,接无菌PDA培养基做空白对照,定时观察记录拍照,等出现症状时,再进行病原菌分离纯化。将菌株GH01在PDA培养基上培养7 d,用无菌水将分生孢子稀释成1×109mL-1,用灭菌接种针在国槐当年生嫩枝上进行喷雾接种,同时喷雾无菌水作空白对照。定时观察记录拍照,等出现症状时,再进行病原菌分离纯化。

1.6 病原菌形态学观察

将分离纯化的16株菌分别接于PDA平板上,置于28 ℃、12 h光暗交替培养。在培养2 d和7 d时,观察记录菌丝形态、颜色,通过光学显微镜观察并记录菌丝及分生孢子的形态和大小,参考Alizadeh等[3]与Pavlic等[4]的研究对分生孢子的各种形态进行观察与描述。

1.7 rDNA ITS序列与2个看家基因的多重序列系统发育分析

采用基因组DNA快速抽提法[5]提取16株菌的基因组DNA,并于-20 ℃保存备用。对rDNA ITS序列和 2个看家基因(EF1-α、LSU)进行PCR扩增,扩增引物见表1。PCR扩增体系为: 10×PCR缓冲液(含Mg2+)5 μL,10 mmol·L-1dNTP 1 μL,10 μmol·L-1正反引物各1 μL,病原基因组DNA 2 μL,5 U·mL-1Taq酶0.5 μL,加ddH2O至总体积50 μL。PCR反应程序为:95 ℃ 预变性2 min:94 ℃变性30 s,按不同扩增序列设置不同退火程序(rDNAITS,55 ℃退火50 s;EF1-α,56 ℃退火50 s;LSU,55 ℃退火1 min),72 ℃延伸1 min, 35个循环; 72 ℃再延伸10 min,4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,将产物送杭州擎科生物股份有限公司测序。序列经BLAST比对分析后,提交至GenBank获得登录号。应用MEGA 11.0软件,采取邻接法利用16个供试菌株与10个参考菌株(表2)[3,6-13]各序列的串联基因构建系统发育树,Bootstrap重复检验1 000次。

表1 扩增引物序列Table 1 Primers for amplification of gene fragments

表2 系统进化分析中使用的菌株及其GenBank登录号Table 2 Botryosphaeriaceae isolates used in the phylogenetic analyses with its GenBank accession number

1.8 病原菌的生物学特性研究

选取代表性菌株GH01进行生物学特性的测定。将菌株GH01在PDA培养基上于28 ℃、12 h光暗交替条件培养2 d后,以无菌打孔器打取菌落周围直径5 mm的菌饼用于以下实验。

(1)培养基种类对病原菌生长、产孢的影响:将菌饼分别置于不同的培养基上,于28 ℃、12 h光暗交替的培养箱中培养24 h,之后采用十字交叉法量取其直径并计算生长速率,观察并记录菌落生长的状况与形态,7 d后无菌水洗下平板表面产生的孢子并利用擦镜纸过滤,使用血球计数板镜检统计产孢数量。每个处理重复3次。(2)温度对病原菌菌落生长、产孢的影响:将新鲜菌饼置于PDA平板中间,分别置于5 、10、15、20、25、30、35、40 ℃的恒温培养箱中培养。同上方法测量菌落大小及产孢数量。每个处理重复3次。(3)湿度对病原菌分生孢子萌发的影响。采用小容器空气湿度法[2],设置10%、35%、50%、75%和90%共5种相对湿度。用灭菌涂布棒蘸取 106mL-1的分生孢子液,均匀涂抹在含有水琼脂培养基的灭菌载玻片上,快速风干后,放置于不同湿度的干燥器中,25 ℃恒温培养6 h后镜检观察孢子萌发状况,并统计孢子萌发率。每个处理重复3次。(4)pH对病原菌生长、产孢的影响:用0.5 mmol·L-1的氢氧化钠溶液与稀盐酸对PDA培养基的pH值进行调整,分别配置pH值为3.5、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培养基。将直径为5 mm的菌饼置于具有不同pH值的培养基上,28 ℃ 光暗交替条件下培养,定期观察菌落形态;7 d后在血球计数板上镜检产孢数量。同时,配制上述pH值的PDB培养基,将直径5 mm菌饼置于其中,25 ℃、150 r·min-1振荡培养。3 d后过滤菌液, 菌丝用蒸馏水冲洗数次, 60 ℃ 烘干称重。每个处理重复3次。(5)病原菌生长及产孢对碳、氮源的利用:以固体查氏培养基为基础,以等质量的阿拉伯糖、可溶性淀粉、果糖、麦芽糖、甘露糖、木糖、山梨糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、半乳糖等碳源代替配方中的蔗糖,制备不同碳源的培养基;以含氮量相同的牛肉膏、硫酸铵、精氨酸、硝酸钾、蛋白胨、草酸铵、苯丙氨酸、硝酸铵、氯化铵、甘氨酸、尿素等氮源,代替配方中的硝酸钠配制不同氮源培养基。以不加任何碳或氮源的培养基为对照,将菌株GH01菌饼接入各培养基中,同上方法测量菌落大小及产孢数量。同时,配制上述配方的液体培养基,分别将菌饼置于其中,25 ℃, 150 r·min-1振荡培养3 d;培养结束后过滤菌液, 菌丝用蒸馏水冲洗数次, 60 ℃烘干称重。每个处理各重复3次。

2 结果与分析

2.1 国槐枝枯病的症状与危害

国槐枝枯病自2018年于库尔勒地区发现。本研究团队从2019年到2022年,在每年的春季、夏季和秋季,对南疆各地的国槐进行病害调查。发现除库尔勒地区外,博湖县、焉耆县和阿克苏市、阿拉尔市等地的国槐也同样出现了枝枯、叶落甚至整树枯死的行道国槐。我们对此进行了调查,并对枝枯病症状进行了详细的观察,发现国槐枝枯病发生普遍,株发病率为50%～70%,危害严重。

该病害最易且最初侵染的是国槐的春梢嫩枝。初期,发病部位会呈现水渍状(图1-A),此后病斑逐渐扩展(图1-B),发病后枝条表皮会由绿色变为黑褐色至灰白色,并形成清晰的病组织与健康组织分界,褪绿部分表面出现明显的黑色点状物质(即病原菌的分生孢子器)(图1-C);此外,病原菌也侵染二年生、多年生的枝条,大枝上表现出病斑,表皮皱缩凹陷,呈现灰白色,病健交界表现为暗红至黑色。随着病情的发展,被侵染枝条将逐渐干枯,枝条上的叶变黄直至落叶(图1-D);在病程后期,大枝表面出现肉眼可见黑色小突起,同时表皮下能够发现大量黑色分生孢子(图1-E、F)。国槐枝枯病在国槐整个生长季都能发生,轻则造成病株花序、果实和小枝条枯死,重则导致病株大枝枯死继而整树枯死(图1-G、H)。病原菌在早春侵染,会导致不开花、不结荚,嫩梢枯死;夏季侵染则豆荚空瘪,无法形成具有生活力的种子。国槐枝枯病的发生对治沙防沙及园林绿化造成严重影响。

A～C,春梢嫩枝发病症状;D,发病枝条枝枯、叶落;E,多年生枝条树皮表面的黑色突起;F,树皮下形成的大量分生孢子;G,多树枝条发病干枯;H,全株即将枯死。A-C,Symptoms on current-year twigs ; D, Branches dieback, leaves falling off; E, Visible black protrusions on epidermis surface ; F, Black conidia formed under the epidermis; G, Most of the shoots are diseased and dry; H, Trees about to die completely.图1 国槐枝枯病的症状Fig.1 Infection symptoms of branch dieback on S. japonicum

2.2 病原菌的分离及致病性测定

对采集的国槐发病枝条通过组织和单胞分离,共得到16株形态学及分子生物学特征一致的菌株,通过组织分离获得GH01、GH02和GH03等3株菌,通过单孢分离获得GH04、GH05、GH06、GH07、GH08、 GH09、 GH10、 GH11、 GH12、 GH13、 GH14、 GH15和GH16等13株菌。选择代表性菌株GH01进行菌丝块接种,接种后4 d即可见接种的嫩枝伤口周围出现水浸状(图2),伤口变黑且病斑沿枝条向两端延伸;接种一个月后,出现与自然发病一样的症状。从接种的发病枝条处分离到与接种菌株相同形态学和分子生物学特征的真菌,明确该菌株为造成国槐枝枯病的病原菌。采用菌株GH01的孢子液接种7 d后,接种部位枝条出现水渍状斑点,而后病斑逐渐扩大,呈椭圆形,病斑边缘黑色,中央枯黄。

A,喷分生孢子液;B,喷无菌水对照;C,菌丝块伤口接种;D,空白PDA培养基对照。A, Sprayed conidial; B, Sprayed sterile water; C, Mycelial inoculation; D, PDA medium control.图2 分生孢子与菌丝块在国槐嫩枝上的接种结果Fig.2 Results of pathogenicity test of conidia and mycelial plugs on S. japonicum branch

2.3 国槐枝枯病原菌鉴定

2.3.1 病原菌形态学特征

将分离得到的16株菌分别置于PDA平板上培养,各菌株形态学特征一致。菌株生长速度快,2 d即可长满90 mm的平板。菌落初期呈白色,气生菌丝发达,呈细绒毛状且部分直立(图3-A);培养3 d后,菌落逐渐变黑,7 d后菌落呈现出正面墨绿色、背面黑色的形态(图3-B)。在光学显微镜下观察,病原菌会产生链状节孢子(arthroconidia),随后节孢子变圆,呈现暗褐色,无隔膜或仅有一个隔膜。不成熟的节孢子会断裂形成短链(图3-D)。在平板培养过程中,未见其分生孢子器。在发病后期的枝条上分离得到了大量分生孢子,它们形态多样,包括无隔孢子[(2.0～5.0) μm×(1.5～4.5) μm]、单隔孢子[(6.5～9.3) μm×(5.0～5.5) μm]、多隔孢子[(9.0～10.6 )μm×(3.5～5.5 )μm]及格砖状孢子[(12.0～16.0 )μm×(11.4～16.0) μm]。从分布数量上看,多数孢子为无隔孢子,其次为单隔孢子,多隔孢子及格砖状孢子数量较少。以上形态学特征,与Alizadeh[2]和Pavlic等[3]对Neoscytalidiumnovaehollandiae(现名N.dimidiatum)的形态特征相符合。

A,PDA培养基培养2 d;B,PDA培养基培养7 d;C,菌丝;D,节孢子;E～F,无隔孢子与单隔孢子;G,双隔孢子;H,格砖状孢子。A, Cultured with PDA medium for 2 d; B, Cultured with PDA medium for 7 d; C, Mycelium; D, Arthrospore; E-F, Septospore and single septospore ;G, Double septospore; H, Lattice spore.图3 病原菌的形态学特征Fig.3 Morphology characters of isolates pathogen

2.3.2 病原菌rDNAITS及2对看家基因的序列特征

对供试16株菌株的rDNAITS与EF1-α及LSU这2对看家基因的序列进行扩增、测序与BLAST比对,发现这16个菌株在rDNAITS序列及LSU基因位点上与多个N.dimidiatum(原名N.novaehollandiae)菌株有100%的相似性,EF1-α与多个上述真菌的相似性达到99%。这说明从南疆发病国槐枝条上分离得到的菌株为新暗色柱节孢N.dimidiatum。将这些序列递交至GenBank数据库获得GenBank登录号(各菌株ITS序列及2对看家基因序列对应的GenBank号见表3)。利用MEGA 11.0版软件对供试菌株以及已登录GenBank的葡萄座腔菌目代表性菌株基于ITS-EF1α-LSU的序列构建联合系统发育树。进化树采用邻接法(Neighbor-joining method, NJ)构建。根据串级序列系统发育树,可以看到16株供试菌株与3个N.novaehollandiae(现名N.dimidiatum)菌株以较高的自举置信度位于同一分支上(图4)。结合Blast比对结果与系统发育分析结果,可以认为从发病国槐枝条上分离得到的致病菌株与新暗色柱节孢N.dimidiatum的遗传距离最小。结合致病性测定及形态学特征,确定引起国槐枝枯病的病原菌为新暗色柱节孢(N.dimidiatum)。

图4 基于ITS-EF1α-LSU基因序列构建的国槐枝枯病原菌16个菌株与其他葡萄座腔菌目菌株的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of S. japonica pathogens and other Botryosphaeriales strains based on combined ITS-EF1α-LSU sequences

表3 培养基对国槐枝枯病原菌GH01菌丝生长及产孢的影响Table 3 Effects of different culture media on mycelial growth and sporulation of Neoscytalidium dimidiatum isolate GH01

2.4 国槐枝枯病病原菌的生物学特性

2.4.1 培养基对病原菌菌丝生长及产孢的影响

培养基种类对菌株GH01菌丝生长与分生孢子形成的影响具有一定差异。对菌丝生长有促进作用的培养基不一定能够促进病原菌的分生孢子形成,同时,利于产孢的培养基也不一定能够促进菌丝生长。综合判断,PDA培养基最适宜国槐枝枯病原菌的菌丝生长及分生孢子的形成,而WA培养基则最不利于病原菌的生长与产孢(表3)。在不同培养基上生长的病原菌落形态也有差异,在NA培养基上生长的菌丝较为致密,而其他供试培养基上生长的菌丝则相对稀疏。

2.4.2 温度对病原菌生长及产孢的影响

不同温度对菌株GH01菌丝生长及分生孢子形成的影响存在一定差异。从实验结果来看,国槐枝枯病原菌在温度≤5 ℃时,既不能进行正常的菌丝生长又无法产生分生孢子;当温度处于10～40 ℃时,病原菌可完成菌丝生长及分生孢子形成;当温度为34 ℃时,菌丝生长速率及产孢数量达到最大值并显著高于其他温度(图5)。

同色块数据后没有相同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。Same color blocks marked without the same lowercase letters indicate signficant (P<0.05) difference.图5 温度对国槐枝枯病原菌GH01菌丝生长及产孢的影响Fig.5 Effects of different temperature on mycelial growth and sporulation of Neoscytalidium dimidiatum isolate GH01

2.4.3 相对湿度对病原菌分生孢子萌发的影响

菌株GH01在相对湿度10%～90%的条件下均能够萌发(图6),但在不同相对湿度下分生孢子的萌发率存在一定差异。在相对湿度10%的条件下,病原菌的6 h孢子萌发率最高;在相对湿度75%与90%的处理下其萌发率无显著性差异。

数据点上无相同小写字母的表示不同处理间差异显著(P<0.05)。Dots marked without the same lowercase letters indicate signficant (P<0.05) difference.图6 相对湿度对国槐枝枯病原菌GH01分生孢子萌发的影响Fig.6 Effects of different relative humidity on spores’ germination of Neoscytalidium dimidiatum isolate GH01

2.4.4 pH对病原菌生长及产孢的影响

菌株GH01在pH值3.5～11的范围内菌丝均能够生长,当pH为5时,菌丝的干重最大,菌球分布均匀,密度最佳。在供试的pH值范围内,病原菌也都能够形成分生孢子,当pH值为7-9时,其产孢量最大。综合来看,偏酸性环境利于国槐枝枯病原菌的菌丝生长;而中性偏碱的环境利于该病原菌分生孢子的形成(图7)。

同一折线数据后没有相同小写字母的表示不同处理间差异显著(P<0.05)。Data in the same line without the same lowercase letters indicate signficant (P<0.05) difference.图7 pH对国槐枝枯病原菌GH01菌丝生长及产孢的影响Fig.7 Effects of different pH value on mycelial growth and sporulation of Neoscytalidium dimidiatum isolate GH01

2.4.5 不同碳、氮源对病原菌生长及产孢的影响

不同碳氮源对菌株GH01的生长及病原菌分生孢子的形成影响具有一定的差异。供试碳源中,木糖、甘油、山梨糖的菌丝生长速率不显著高于无碳源的对照培养基,即这4种碳源无法被国槐枝枯病原菌丝生长所利用。在各不同碳源培养基上生长的菌丝干质量与其生长速率大致呈正相关(表4)。从病原菌的产孢数量来看,所有供试碳源均无法被病原菌产孢所利用。

在供试氮源中,除牛肉膏外菌株在其余氮源培养基上的生长速率均小于对照组,但由于菌丝疏密程度不同,其在蛋白胨、精氨酸等多种氮源培养基中生长的菌丝其干质量高于对照组;此外蛋白胨、苯丙氨酸、草酸铵及牛肉膏也可以较好地为病原菌的产孢所利用(表5)。

表5 不同氮源对国槐枝枯病原菌GH01菌丝生长及产孢的影响Table 5 Effects of different N sources on mycelial growth and sporulation of Neoscytalidium dimidiatum isolate GH01

3 讨论

通过对国槐枝枯病菌的形态学特征观察及rDNA ITS序列与EF1α、LSU这2对看家基因的序列系统发育分析,明确引起南疆地区国槐枝枯病的病原菌为新暗色柱节孢(N.dimidiatum)。据我们所知,这是一种之前未见报道的新病害。病原菌新暗色柱节孢是Crous等[14]在研究葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)的18个属系统发育关系时重新整合建立的新种组合,近年,真菌分类学界又对该菌种的分类学地位进行了新的界定,将原Neoscytalidium属的3种植物病原菌N.hyalinum、N.novaehollandiae、N.orchidacearum都囊括在了新暗色柱节孢N.dimidiatum中[15]。本次分离得到的病原菌N.novaehollandiae也因此被界定为新暗色柱节孢。根据前人的研究报道,病原菌新暗色柱节孢(N.dimidiatum)的寄主范围广泛。它能侵染危害松树[3]和桑树[16],且梨树[17]、苹果树[18]、山楂树[19]、葡萄[20]和杏树[21]也是新暗色柱节孢的易感寄主,这些寄主广泛分布于南疆和北疆。除了这些寄主外,南疆还广泛分布有柳树、杏树、核桃树、沙枣树和其他种类的槐树,据我们初步观察,柳树、黄金槐也有类似的症状引起大量枝条枯死。若南疆的梨树、苹果树、杏树、核桃树、山楂树也会被该菌侵染,其危害巨大,因此非常有必要开展进一步的研究。据报道,该病原菌的快速传播已造成土耳其、伊朗等地的严重经济损失[2,20-21]。南疆地区的气候条件与上述国家及地区十分相近,存在病害严重发生的可能。 在病原物潜在寄主范围广、气候条件适宜的南疆,明确新暗色柱节孢所引起病害的致病及流行机制、寄主范围、病害的防治措施等,对于支持该地区的果树产业发展、减少经济损失十分重要。上述问题有待进一步研究解决。

综上,本研究发现,造成新疆南疆地区大量行道国槐枝枯、叶落甚至枯死的病原菌为新暗色柱节孢(N.dimidiatum),该病原菌在10 ～ 40 ℃均可以生长,最适生长温度为34 ℃,相对湿度较低时,分生孢子的萌发和生长速度更快。该菌株最适碳源为甘露糖,而对木糖、山梨糖的利用效果较差;最适氮源为牛肉膏、蛋白胨,而对硝态氮的利用效果较差,对尿素的利用效果最差。在实际生产过程中,应加强苗木的管护、及时清除销毁病枝病树,严防病害的传染以减少其造成经济及生态损失。