针刺治疗通过抑制细胞凋亡改善缺血性脑卒中疗效及其机制

王记委 李雁冰 李娜 李梦迪 郭敏芳 孟涛 马存根 尉杰忠,3

(1山西中医药大学神经生物学研究中心 国家中医药管理局益气活血法治疗多发性硬化重点研究室,山西 晋中 030619;2山西大同大学脑科学研究所;3大同市第五人民医院)

缺血性脑卒中(CIS)是一种常见的中枢神经系统疾病,占所有脑血管病例的 70%～80%〔1〕,是世界范围内第二大常见死因和长期残疾的主要原因〔2〕,也是导致痴呆症的第二常见原因。由于人口老龄化及糖尿病、肥胖等发病率的增加等原因,预计在未来几十年内CIS的发病率将增加〔3〕。因此,CIS被认为在全球的疾病负担会持续加大,但目前的药物疗法在实用性和有效性方面仍受到限制〔4〕,而且缺血损伤的组织在血流恢复后难以得到有效的改善,反而可能加重损伤。虽然机械取栓可显著改善脑缺血再灌注损伤(CIRI),但CIS患者因缺血导致长期预后较差而疗效欠佳〔5〕。作为其主要致病因素,迟发性神经元死亡是影响预后的非常关键的因素,而称为程序性死亡的神经细胞凋亡被广泛认为是其主要途径〔6〕。

针灸疗法通过刺激经络穴位,激活人体内的自我调节机制,改善缺血后神经功能,在临床上有较好的效果〔7〕。目前常用的针刺疗法分为针法治疗和电针治疗。针法是指运用中医的传统思维方法,根据辨证论治的理论把针具按照不同的方式刺入患者身体,再利用其不同的操作手法如捻转、提插和振动等进行刺激的方式达到治疗疾病的目的。而电针疗法则是通过将针插入穴位,之后通过一定的电流刺激以达到治疗效果〔8〕。本文主要收集近年来通过针刺的方法治疗CIS,并探讨其抑制细胞凋亡的机制的文章,进行综述。

1 细胞凋亡与CIS

1.1细胞凋亡 细胞凋亡是指伴随着细胞内组织的变化所导致的体积逐渐减少、细胞核的碎裂和染色质的缩小从而使细胞失去活性。这种特殊的细胞死亡是细胞最基本的死亡方式之一,在正常生理状态下通过激活基因编码的自杀程序来为机体去除不必要或潜在有害的细胞〔9〕。细胞凋亡是细胞的一种调节程序,在生物体发育和生长过程中具有重要的作用。尽管在癌症或自身免疫状态下会发生细胞凋亡不足,但在退行性疾病、免疫缺陷和不孕症中,细胞凋亡加速〔10〕。所以虽然细胞凋亡的发生必不可少,但是凋亡不足或者过多都会导致疾病的发生。细胞凋亡主要有两种途径:一是内在途径,也称为线粒体途径,B细胞淋巴瘤(Bcl)-2家族促凋亡蛋白(Bak/Bax)的寡聚化激活。Bak/Bax低聚物在线粒体外膜形成孔,导致细胞色素(Cyt)C释放到细胞质中。Bak/Bax的活化由Bcl-2家族促凋亡〔如Bcl-2相关启动子(Bad)和BH3结构域凋亡诱导蛋白(Bid)〕或抗凋亡(如Bcl-2)Bcl-2家族蛋白调节〔11〕。CytC与凋亡酶激活因子(Apaf)-1结合,Apaf-1募集半胱天冬酶(Caspase)-9前体,形成细胞凋亡体。在细胞凋亡体中,Caspase-9被自体蛋白水解切割激活,启动Caspase处理级联反应〔12,13〕。二是外在途径,又被称为受体为媒介传导的途径,通过膜受体的参与激活,例如肿瘤坏死因子受体(TNFR)1、死亡受体或 Toll 样受体(TLR)。这些蛋白质诱导涉及TNFR1相关死亡结构域蛋白(TRADD)或自杀相关因子(Fas)受体相关死亡结构域蛋白(FADD),受体相互作用导致丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RIPK)1和pro-Caspase-8的信号复合物的形成〔14〕。细胞凋亡抑制剂(cIAPs)对RIPK1的泛素化稳定了复合物并诱导转录因子核因子(NF)-κB的活化,死亡诱导信号复合体(DISC)中的凋亡抑制蛋白限制Caspase-8活性,同时促进细胞存活,细胞增殖和促炎细胞因子的产生。该途径中的不平衡,例如细胞应激施加的不平衡,允许Caspase-8和Caspase-10的激活,这反过来又触发了Caspase激活级联反应。一旦激活,Caspase(即Caspase-2,-6,-8和-10)会导致程序性凋亡死亡〔15,16〕。

1.2细胞凋亡与脑缺血之间的关系 临床上,CIS主要是由于大脑内动脉堵塞之后,脑细胞缺血缺氧使细胞发生凋亡或坏死〔17〕。与此同时,神经元的血液供应被破坏,随后促进一连串的病理生理反应,导致细胞损失。多种机制单独或联合参与这种疾病,包括兴奋性毒性、线粒体死亡途径,自由基释放,蛋白质错误折叠,氧化应激、细胞凋亡,钙超载、坏死,自噬和炎症等〔18,19〕。脑细胞缺血缺氧后激活相关凋亡基因的表达,通过相关途径使神经细胞发生凋亡〔20〕。在脑缺血的治疗过程中主要分为两种,一种为神经保护,防止受损神经元在脑缺血急性期死亡,另一种为干细胞疗法,理论上可以在脑缺血的慢性期用新生神经元/神经胶质细胞修复断裂的神经元网络〔21〕。又知神经元凋亡是脑梗死的重要表现,提示可能是由凋亡相关因子的调节诱导的脑缺血治疗中,使用治疗措施抑制凋亡信号通路c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素机械靶蛋白(mTOR)、非受体蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信号转导与转录激活因子(STAT)等〔22〕,调控下游凋亡分子(Bcl-2家族、Caspase家族、Fas受体等)的表达,从而保护神经达到治疗效果〔23〕。活性氧(ROS)是完整细胞中线粒体损伤后所诱导的重要物质〔24〕,也是CIRI引起的氧化应激产物。为了应对缺氧,低氧诱导因子-1(主要是在细胞内氧气浓度不足对其调控的相关因子)被ROS激活可诱导自噬〔25〕,并导致细胞凋亡。所以,也可以通过调节线粒体功能障碍和抑制氧化应激来抑制细胞凋亡〔26〕。

2 针刺治疗CIS的机制与疗效

临床试验表明,针灸可以增强平衡〔27〕,减少痉挛,增加肌肉力量,促进中枢神经系统驻留细胞的增殖,通过血管生成和调节血管活性介质调节脑血流量,通过直接干预内在和外在途径或相关途径来抗细胞凋亡,调节缺血级联反应中涉及的神经化学物质,增强和恢复海马记忆和学习过程〔28〕。有研究表明针康法通过调节细胞凋亡抑制蛋白1的表达,抑制Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3活化,降低脑缺血大鼠缺血半暗区神经元凋亡,减少细胞凋亡数量〔29〕。针灸还可以减少脑缺血/再灌注后的炎症反应,并促进损伤神经系统的修复〔30〕,激活轴突再生和发芽,改善突触的结构和功能。临床得出电针(EA)联合跑台训练改善局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损,抑制炎症反应,使神经功能改善〔31〕。这些过程修改了受损大脑区域的神经网络和功能,从而提高了各种技能和适应性〔32〕。有研究表明通过调节一系列参与氧化还原调节的分子信号通路,针灸不仅可以激活固有的抗氧化酶系统,还可以抑制ROS的过度生成。针灸疗法缓解了脑缺血引起的氧化应激,与针灸的神经保护作用密切相关〔33〕。

3 针刺抑制CIS细胞凋亡的机制

细胞凋亡在脑缺血过程中非常重要,而内源性和外源性又是细胞凋亡的主要原因。见图1。

图1 细胞内源性及外源性凋亡

3.1通过Bcl-2家族抑制细胞凋亡 Bcl-2蛋白家族通过控制线粒体凋亡来控制细胞是死是活。哺乳动物Bcl-2家族由20多个成员组成,这些成分根据它们在β-螺旋区域中的Bcl-2同源结构域及它们在细胞凋亡过程中的功能进行分类。其中抗凋亡成员如Bcl-xL、Bcl-w或Bcl-2,通过阻止与促凋亡蛋白(Bim、Bak或Bax)成员相关的电压依赖性阴离子通道的开放或通过抑制促凋亡形成的分子开口组装来抑制细胞凋亡〔34〕,抗凋亡成员和促凋亡成员间的微妙平衡决定了细胞的生死,因此靶向Bcl-2蛋白家族内的蛋白质-蛋白质相互作用是控制细胞凋亡的关键策略〔35〕。

所有Bcl-2家族成员都不同程度地拥有一个或多个Bcl-2同源结构域,允许与各种促细胞凋亡蛋白相互作用,具有阻止细胞凋亡的能力。Bcl-2和密切相关的Bcl-xl和Mcl-1可以保护细胞免受各种可能导致凋亡的刺激,包括辐射、生长因子戒断和化学疗法。而Bax、Bak和Bim作为促凋亡蛋白,和Bcl-2相似,包含三个结构域,在促进细胞凋亡方面效果显著〔36〕。故可知调节抗凋亡与促凋亡的意义非常重大。EA不同的经络穴位刺激可以导致大鼠心及脑组织细胞一定程度的凋亡指数减少,心、脑组织Bcl-2蛋白增加,Bax减少,从而抑制了细胞凋亡,使细胞存活〔37〕。有研究表明使用EA刺激水沟治疗脑缺血,抗凋亡Bcl-2蛋白明显增高〔38〕。又有研究证明利用ST36(足三里)在缺血前多次进行EA刺激可以有效地增加转化生长因子-β1和Bcl-2的产生,这些蛋白质共同作用以减少CIRI后脑组织损伤的程度,此外,转化生长因子-β1还能通过调节凋亡级联反应促进具有神经保护作用的蛋白质对抗预期的氧化应激〔39〕。EA刺激百会和神庭可能会诱导Bcl-2 mRNA的过表达并抑制Bax发挥其抗凋亡作用,保护神经元免受损伤,因此EA通过调节Bcl-2家族的表达来改善CIRI的疗效是确定的〔40〕。

3.2通过Caspase家族抑制细胞凋亡 Caspase是一种在进化上较为保守的半胱氨酸依赖性内切蛋白酶分子,细胞凋亡过程中Caspase作为起始者激活相关Caspase执行,随后协调它们的活动,以破坏关键的结构蛋白并激活其他酶〔41〕。此外,有文献发现了炎症性Caspase还具有能促进细胞焦亡的机制,这是另一种不同的裂解细胞死亡模式,与炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β和 IL-18 的分泌有一定的关系〔42〕。Caspase 是一种IL-1β 转换酶家族蛋白酶,到目前为止已经被发现存在有 14 种Caspase,它们都有一些共同的特性并且都是天冬氨酸特异性的Caspase〔43〕,它们对体内神经元凋亡的任何影响可能是通过它们对炎症反应的调节间接导致的,既可以作为凋亡刺激的初始传感器,也可以作为死亡的最终刽子手。其中Caspase-1和Caspase-11主要参与促炎细胞因子的加工,Caspase-3 和 Caspase-9 对大脑的发育过程中细胞凋亡有很重要的影响。Caspase 8 是对于造血谱系细胞增殖、心肌的发育和死亡受体介导的细胞凋亡至关重要,因此确定哪些Caspase在脑中表达和激活将显著阐明细胞凋亡在针刺治疗脑缺血中的作用。研究表明,Caspase在细胞信号转导事件中发挥作用,包括细胞凋亡、细胞生长和分化〔44〕。在研究中,EA外关和足三里穴位,可以通过抑制NOD样受体蛋白结构域相关蛋白(NLRP)3诱导的Caspase-1激活来减少细胞凋亡,从而降低神经元的损伤〔45〕。使用百会和水沟,Caspase-9阳性细胞显著减少,减少其过度表达,防止了高血脂脑缺血的损伤〔46〕。利用电针“合谷”“尺泽”“足三里”“三阴交”,使脑缺血再灌注后细胞凋亡指数及脑梗死体积百分比降低,改善了神经功能,其机制与Caspase-3表达减少相关〔47〕。又有电针预处理百会可以通过降低Caspase-3蛋白的表达减少缺血再灌注损伤后的神经元凋亡〔48〕。

3.3通过Fas受体 TNF和神经生长因子受体家族的成员Fas是属于死亡受体家族的膜蛋白。由Caspase激活介导,通过其配体FasL或激动性抗Fas抗体并交联Fas,携带跨膜受体Fas的细胞在结合表达FasL细胞后可以迅速发生程序性细胞死亡〔49,50〕。通常地表达或没有Fas抗原的细胞表面上Fas的上调可能会发生在许多病理情况下,通过Fas/FasL途径导致细胞死亡。细胞毒性药物(特别是已知会导致DNA损伤且目前用于治疗的药物)诱导细胞中Fas 表达增强,表明使用药物/抗 Fas 组合可以进行有效治疗〔51〕。通过电针刺激百会(DU20)和神庭(DU24)显著下调了促凋亡Bax和Fas的表达,缓解了脑缺血大鼠的细胞损伤。又有利用眼针治疗脑卒中发现Fas的含量降低,从而抑制细胞凋亡,达到治疗脑卒中的作用〔52〕。

3.4内质网(ER)应激 由外源性或内源性因素触发的ER蛋白折叠的消亡,刺激细胞应激反应,称为ER应激。在严重毒性或长期存在ER应激的情况下,ER应激通过称为ER未折叠蛋白质反应,将致命的信号传输到线,而线粒体是凋亡和自噬细胞死亡的关键,因此,ER在感知和协调应激途径并维持整体生理稳态方面至关重要〔53〕,并通过这些调节细胞凋亡。来自ER的信号通路参与由ER应激,癌基因表达,死亡受体连接和氧化应激等多种刺激引发细胞凋亡〔54〕。针刺可以通过蛋白激酶R样ER激酶(PERK)、肌醇依赖性激酶(IRE)1和激活转录因子(ATF)-6通路抑制中脑动脉栓塞诱导的ER应激,导致细胞凋亡受到影响。此外,4-苯基丁酸钠盐抑制ER应激可进一步抑制自噬和细胞凋亡,从而加强针刺的保护作用〔55〕。CIRI后大鼠大脑中ER发生应激反应,在它当中存在的ATF-6及IRE1两个凋亡通路开始活化并随之促进细胞凋亡,使用EA结合脑内注射药物,发现了其能通过抑制ER应激相关蛋白IRE1、和ATF-6的表达,从而抑制IRE1及ATF-6凋亡通路来实现降低细胞凋亡〔56〕。

3.5CytC的释放 线粒体对生命至关重要。它们位于细胞代谢的核心,通过氧化磷酸化在三磷酸腺苷(ATP)生成中发挥关键作用〔57〕。而CytC在为细胞的命运做出生死攸关的决定中起着关键作用。它是一种小球状、高度保守的有104个氨基酸组成的蛋白质,具有共价连接的血红素基团,具有多种功能和催化活性〔58〕。在线粒体内膜中,存在于内的CytC在线粒体电子传输链有密切关系,使用其血红素基团作为氧化还原的中间产物在复合物Ⅲ和复合物Ⅳ之间穿梭电子。当细胞检测到凋亡遭受到刺激时,例如DNA损伤、未折叠蛋白或代谢应激的存在,内在的凋亡途径开始被激活〔59〕在细胞应激作用下,CytC被线粒体所释放是细胞凋亡的关键一步,在脱氧ATP和ATP共同存在的条件中与细胞凋亡蛋白酶活化因子1相互作用,并且当CytC从线粒体中释放到胞质溶胶当中,蛋白凋亡蛋白酶激活因子-1就会与其发生相互作用,从而导致凋亡体的形成,通过Caspase的特定方式收集Caspase-9前体,然后促进其裂解成活性形式,随后通过多米诺反应导致了下游Caspase活化,使线粒体不能避免地发生了凋亡,最后使细胞开始死亡〔60〕。CytC被证明是细胞信号通路的靶点,通过组织特异性磷酸化调节CytC的功能。但根据现有文献针刺下调CytC表达,对它的抑制作用不明显,途径可能不是针刺抑制新生大鼠神经细胞凋亡作用的通路。由于针刺治疗这方面的文章较少,具体是否可以作为抑制细胞凋亡的途径,有待进一步实验观察。

综上所述,针刺在治疗CIRI的过程中抑制细胞凋亡是具有治疗效果的,并且使用针刺治疗不仅对机体损害较小,而且效果显著,在凋亡的途径当中,内源性,外源性和其他通路方面的研究均有不错的成果,而且细胞凋亡对于氧化应激和炎症反应等都有一定的相互作用,但作为治疗方向,依然需要进一步研究,在一些凋亡通路方面的研究针刺的文献较少作用靶点不太清楚,例如CytC,但以现有在其他通路方面的现有文献来看其对于治疗CIRI有确定的疗效。希望在针刺治疗脑缺血方面有更深入的研究。