环氧合酶-2抑制剂对佐剂性关节炎大鼠胃黏膜的影响

贺清 丁瑞峰 黎敏 陈楠 吴昆 张爱民

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院,内蒙古 包头 014010)

选择性环氧合酶(COX)-2抑制剂是一种新型非甾体抗炎药(NSAIDs),塞来昔布对COX-2受体有较高的选择性,疗效与传统NSAIDs相当且不良反应少〔1〕。然而有研究发现在关节炎大鼠中单次大剂量应用塞来昔布(100 mg/kg)会出现类似于传统NSAIDs胃黏膜损伤〔2〕,使用塞来昔布治疗的关节炎患者,胃肠道不良事件发生率为0.34%,布洛芬和萘普生的分别为0.74%、0.66%〔3〕。目前选择性COX-2抑制剂的安全性仍具有争议。类风湿关节炎的动物模型在人类疗效的可预测性方面已得到证实〔4〕,因此本实验通过建立佐剂性关节炎大鼠模型,给予治疗量的塞来昔布灌胃,探究其是否加重佐剂性关节炎大鼠胃黏膜损伤及机制,为临床安全用药提供基础研究依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组方法 SPF级成年雄性SD大鼠32只,体质量500～600 g,210～240日龄,由北京斯贝福生物技术有限公司提供〔实验动物机构许可号:SCXK(京)2019-0010〕。饲养温度20～25 ℃,湿度50%～70%,光照周期12 h∶12 h,喂食标准的食物和水。大鼠适应性饲养1 w后,按照体质量分层原则随机分为4组,每组8只,分别为空白对照组(正常大鼠+甲基纤维素)、关节炎组(关节炎大鼠+甲基纤维素)、正常给药组(正常大鼠+塞来昔布)、关节炎给药组(关节炎大鼠+塞来昔布)。每天至少对动物的健康进行两次评估,对发生与实验无关不良反应的大鼠给予过量水合氯醛处死。实验操作流程符合《实验动物管理和使用指南》的规定,遵循包头医学院第一附属医院动物伦理操作规范。

1.2主要试剂及仪器 塞来昔布胶囊(美国辉瑞公司,国药准字J20140072,批号AL5873);弗氏完全佐剂(美国Sigma公司,型号F5881-10ML,批号SLCB4664);甲基纤维素(美国Sigma公司,型号V900506-250G,批号WXBD00S9V);反转录酶(M-MLV)反转录试剂盒(Promega公司);实时荧光定量-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增试剂盒(德国Qiagen公司);琼脂糖(Agarose,美国Promega公司);焦碳酸二乙酯(DEPC,美国Sigma公司);前列腺素(PG)E2酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国R&D公司);Real-Time PCR仪(美国ABI公司,型号:7500 Fast Real-Time PCRABI 7500 fast)。

1.3佐剂性关节炎模型的制备 关节炎组、关节炎给药组通过右足底皮下注射完全弗氏佐剂200 μl建立类风湿关节炎大鼠模型,空白对照组、正常给药组给予相同剂量生理盐水。相较于空白对照、正常给药组而言,造模3 d后的关节炎组、关节炎给药组右后足跖部明显肿胀,皮温明显升高,7 d后继发性炎性反应,表现为耳廓、足趾关节踝关节不同程度的发红、肿胀,活动受限,提示造模成功。

1.4实验方法 关节炎组、关节炎给药组造模1 w后开始给予塞来昔布(20 mg/kg,溶于1%甲基纤维素中,灌胃容积5 ml/kg),灌胃28 d,空白对照组、正常给药组给予相同剂量甲基纤维素,药物均现用现配。实验第42天开始禁食36 h后,10%水合氯醛0.1 ml/100 mg腹腔注射麻醉处死全部大鼠,取胃组织,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗干净。

1.5组织病理学观察 从幽门部沿胃大弯剪开,取1 cm×1 cm胃标本置4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,常规病理切片,苏木素-伊红(HE)染色,光学显微镜观察。由专人盲法阅片,每个样本随机计数 20个视野,对每个视野按标准进行单独评分,取20个视野最后平均数为最终病理评分。胃黏膜损伤病理评分标准〔5〕:显微镜下观察胃组织切片1 cm范围,上皮细胞及或腺体破坏,计1分;上层黏膜充血或水肿,计2分;中、下层黏膜充血、出血性损害,计3分;深层坏死或溃疡形成,计4分;计算每张切片的累积评分。

1.6ELISA检测胃黏膜PGE2 各标本相同部位取胃组织块称质量50 mg,置冻存管中液氮冷冻保存备用。按照ELISA试剂盒说明测定胃黏膜PGE2的含量。

1.7RT-PCR检测胃组织内COX-1和COX-2 mRNA的表达 各标本相同部位取胃组织块称质量50 mg,置冻存管中液氮冷冻。将组织从液氮中取出研磨成粉,采用Trizol法提取组织总RNA。按M-MLV反转录试剂盒说明将提取的总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件:70 ℃ 60 min,70 ℃ 10 min。以cDNA为模板,进行PCR扩增,引物由上海生物工程有限公司设计合成:COX1正向:5′-GCAGGGATACCTCGTCGTTA-3′,反向:5′-GGGCATCCATGCAGTCATTC -3′(197 bp);COX2正向:5′-TACAAGACGCCACATCACCT -3′,反向:5′-GACAGCTGGGAGAATTGTTCA-3′(188 bp);GAPDH正向:5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′,反向:5′- GACTGTGGTCATGAGTCCT -3′(136 bp)。RT-PCR程序设置:预变性:94 ℃ 2 min,循环反应:94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s(40个循环),最后于72 ℃ 10 min 收集溶解曲线。用2-ΔΔCt计算各个样本目的基因的表达变化。

1.8统计学处理 采用SPSS24.0软件进行Kruskal-Wallis检验、Nemenyi检验;数值采用中位数(四分位数)表示。

2 结 果

2.1大鼠一般情况 空白对照组、正常给药组直到实验结束时大鼠毛发整齐平顺有光泽,活动、大便如常,正常给药组部分出现食欲下降。关节炎组、关节炎给药组造模后第3天开始出现右后足红肿、皮温升高、关节肿胀、变形,第7天达到高峰,第14天出现对侧后足肿胀,右后足关节僵硬变形,皮下结节多而明显。用药后关节炎给药组右后足周径逐渐下降,给药第2天关节炎给药组部分出现少动、易激,部分毛发失去光泽,无明显食欲下降等。

2.2胃黏膜病理组织学观察及评分 胃黏膜HE染色示:空白对照组胃黏膜结构完整,胃小凹和腺体清晰,未见明显损伤及炎症反应;关节炎组胃黏膜上皮脱落,血管扩张;正常给药组胃黏膜出现轻度黏膜脱落,范围较小;关节炎给药组胃黏膜出现深层黏膜损伤,血管扩张(图1)。关节炎给药组胃黏膜损伤评分较空白组对照组、正常给药组明显增加(P<0.05),但与关节炎组无显著差异(P>0.05)。见表1。

图1 各组胃病理(HE染色,×400)

表1 各组胃病理评分、胃黏膜PGE2含量及COX-1、COX-2 mRNA比较〔M(P25～P75),n=8〕

2.3胃黏膜COX-1、COX-2 mRNA的相对密度 正常给药组胃黏膜的COX-1、COX-2 mRNA相对密度与空白对照组无显著差异(P>0.05);关节炎组COX-1、COX-2 mRNA较空白对照组和正常给药组表达明显增加(P<0.05);关节炎组COX-1、COX-2 mRNA相对密度与关节炎给药组比较,无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.4胃黏膜PGE2的含量 正常给药组胃黏膜PGE2的含量与空白对照组相比无明显差异(P>0.05);关节炎组、关节炎给药组PGE2与空白对照组比较均明显降低(P<0.05);关节炎组PGE2显著低于正常给药组(P<0.05)。与关节炎组比较,关节炎给药组PGE2的含量无明显差异(P>0.05)。见表1。

3 讨 论

选择性COX-2抑制剂通过保留具有保护性的COX-1,同时抑制具有促炎性的COX-2,从而在发挥抗炎、镇痛等作用的同时避免胃黏膜损伤。COX-1是构建型环氧合酶,存在于大多数组织中,在炎症应激等情况下可轻度增高〔6〕;COX-2是诱导酶,在健康组织中的表达水平较低,但可在多种刺激下迅速被诱导。PGE2合成存在两种:瞬时型和延时型。瞬时型为受到刺激后即合成,延时型则是在诱导后数小时才发生。这种不同与PGE2合成酶和环氧合酶有关,PGE2合成酶有3种,胞质型PGE合成酶及两种膜结合型PGE合成酶(mPGES-1和mPGES-2)〔7〕。COX-1和胞质型PGE合成酶协同维持PGE2的组成性水平,而在炎症状态下由COX-2和mPGES-1负责PGE2水平的升高,催化延迟型PGE2产生,且mPGES-1是唯一的诱导酶〔8〕。

本研究表明,治疗剂量下塞来昔布对健康大鼠的胃黏膜几乎无损害作用,Kato等〔2〕的研究中也证明了这一点。Silverstein等〔9〕研究表明选择性COX-2抑制剂已安全地用于健康人且不会引起胃黏膜损伤。关节炎组与空白对照组相比病理评分明显增加,且COX-1、COX-2表达增加,这可能是由于关节炎引起的全身慢性炎症所致。类风湿关节炎是一种全身性自身免疫性疾病〔10〕,刘健等〔11〕研究发现,佐剂性关节炎大鼠胃黏膜细胞超微结构发生了改变,表现为线粒体肿胀变性,棘突破坏或消失,细胞凋亡率高于正常大鼠,这可能是关节炎大鼠胃黏膜损伤的原因之一。Kato等〔2〕表明,COX-2主要在关节炎大鼠胃黏膜巨噬细胞中表达,并且胃黏膜血管通透性较正常大鼠有所增加,关节炎大鼠本身患有慢性全身炎症,胃黏膜中COX-2的表达和巨噬细胞数量的增加可能与此有关。PGE2通过增加胃黏膜微血管血流量和黏液分泌、抑制白细胞黏附血管内皮等参与消化道黏膜微循环的调节和损伤的修复〔12〕,本研究发现,关节炎大鼠PGE2的含量较空白对照组大鼠明显下降,推测可能与其在胃黏膜修复过程中的消耗有关。Takeuchi〔13〕指出,PGE2通过上调血管内皮生长因子(VEGF)表达和激活前列腺素4受体刺激血管生成,对胃黏膜损伤有促进愈合的作用。血管生成是愈合过程的关键,受促血管生成因子(如VEGF)和抗血管生成因子(如内皮抑素)的调节,这种情况在类风湿关节炎〔14〕和实验性溃疡〔15〕愈合中均存在。因此关节炎黏膜局部PGE2减少,内皮抑素与VEGF的比值增加,也会使损伤胃黏膜愈合受到限制。Kato等〔2〕通过诱导较敏感的深色刺豚鼠(DA大鼠)建立关节炎模型,发现单次大剂量使用塞来昔布(100 mg/kg)虽在正常大鼠中不会造成胃黏膜损伤,但在关节炎大鼠中确实会造成类似于传统NSAIDs药物的胃黏膜受损。而我们观察到应用治疗剂量塞来昔布的SD关节炎大鼠,并不会加重关节炎所致的胃黏膜损伤,这与Blackler等〔16〕研究一致,他们发现接受塞来昔布(10 mg/kg,2次/d,14 d)灌胃的关节炎大鼠其胃黏膜损伤程度可以忽略不计,推测这些损伤差异可能与药物具体的种类、剂量、用药时间、实验鼠种等有一定的关系。

综上,塞来昔布不会造成正常大鼠胃黏膜损伤,也不会加重关节炎大鼠胃黏膜损伤,在考虑整个胃肠道的安全性时,目前研究支持使用昔布类而不是传统NSAIDs。然而,使用该药物应与心血管疾病风险相平衡,尤其是在心血管疾病高风险患者中。必要时应规定传统NSAID或“昔布类”的最短持续时间和最低有效剂量〔17〕。