辣木叶通过NF-κB 通路介导血管性痴呆小鼠mTOR、Cdc42的表达对学习记忆功能及海马神经元的保护机制

刘媛媛 孙杨 李超 尹帅 隋月林 张海峰 刘冀

(1沧州医学高等专科学校解剖教研室,河北 沧州 061001;2河北省沧州中西医结合医院)

血管性痴呆(VD)是全球第二大最常见的痴呆形式,是由脑血管疾病引起,患者往往表现出高级认知能力的严重损害〔1〕。氧化应激反应是引起VD患者海马神经元凋亡损害学习、记忆功能的重要病理基础,核因子(NF)-κB 作为一种关键性因子,在细胞受到氧化应激等信号刺激后被活化〔2〕。研究报道在大鼠脑缺血模型中,海马NF-κB表达升高,进而诱导过量兴奋性氨基酸,导致神经元损伤,同时释放氧化自由基、一氧化氮,引起细胞的毒性损害〔3〕。因此抗氧化也是治疗VD的主要策略。作为一种天然药物,辣木叶具多种生物学活性,包括抗糖尿病、抗炎、抗癌、抗缺血、抗疟原虫等〔4〕。研究显示辣木叶可体外保护牛乳腺上皮细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激损伤〔5〕。也有研究发现辣木叶提取物能够减轻同型半胱氨酸诱导的阿尔茨海默病动物模型的神经损伤,缓解认知障碍〔6〕。但辣木叶对VD的作用尚不明确。本研究基于氧化应激反应分析辣木叶对改善VD小鼠学习记忆功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 SPF级雄性BALB/c小鼠,6～8周龄,体质量(20±2) g(河北医科大学实验动物中心,合格证为:医动字第04057号)。水迷宫购于上海新软信息技术有限公司。苏木素-伊红(HE)、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于碧云天公司。Trizol试剂购于Aidlab公司。RNAspin Mini试剂盒购于GE Healthcare公司。BestarTMqPCR试剂盒购于DBI Bioscience公司。抗体购于Abcam公司。聚偏二氟乙烯膜购于EMD Millipore。化学发光法显色试剂盒购于Thermo Fisher公司。显微镜购于Carl Zeiss公司。

1.2动物分组、建模和干预 参照Himori法制备VD小鼠模型〔7〕,通过腹腔注射1%戊巴比妥钠(浓度为20 g/L,剂量为2 ml/kg)麻醉小鼠,麻醉完成后将小鼠仰卧固定,将颈部毛发剔除后切开暴露双侧颈动脉,利用栓线阻断双侧颈总动脉10 min,然后再灌注24 h。通过水迷宫实验检测目标象限停留时间<20 s且穿越平台次数<4次为建模成功。将建模成功的120只小鼠随机分为VD组,辣木叶低、中、高剂量组,每组30只。根据参考文献〔8〕制备辣木叶提取液并灌胃,剂量分别为100、200、400 mg/kg,1次/d,连续28 d。另取30只健康BALB/c小鼠作为对照组,对照组仅暴露双侧颈动脉。对照组及VD组每日使用等体积双蒸水灌胃。

1.3水迷宫实验 用水注满水迷宫,水迷宫温度维持在(25±1)℃。平台浸入水下1 cm。定位导航:各组置于水迷宫四象限,观察90 s内是否登上平台。频率为4次/d,每次间隔时间>2 min。探索:各组小鼠置于同一个象限中,观察90 s内靠墙运动轨迹,并记录各组平台停留时间、穿越平台次数。

1.4HE染色 固定海马神经元组织,时间48 h,流水进行冲洗。使用多浓度乙醇脱水,使海马神经元浸入石蜡中,切片,厚度为4～7 μm。脱蜡、水化、HE染色。苏木素细胞核染色5 min,伊红细胞质染色1～2 min。光学显微镜(ECLIPSE Ni,Nikon USA)下观察。

1.5ELISA ELISA检测氧化应激指标,包括血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛 (MDA)。研磨海马组织4 ℃ 2 000 r/min离心20 min后取上清,抗体孵育2 h,加入显色剂,时间10 min。450 nm下测定吸光度。

1.6RT-qPCR 提取总RNA,逆转转录为cDNA,qPCR实验使用BestarTMqPCR预混液,RT-qPCR分析使用Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统。计算mRNA的相对表达量。

1.7Western印迹检测蛋白 裂解海马组织,离心,收集总蛋白,分离蛋白质,转膜,脱脂牛奶封闭2 h。一抗4 ℃孵育24 h,二抗室温孵育1 h。显影后计算灰度值。

1.8统计学处理 每个检测设立3个平行实验,重复3次。采用SPSS21.0软件进行方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1辣木叶提取液对VD小鼠学习、记忆功能的影响 5组学习记忆能力比较差异显著(P<0.05)。VD组目标象限停留时间和穿越平台次数显著低于对照组(P<0.05);辣木叶低剂量组显著高于VD组(P<0.05);辣木叶中剂量组显著高于辣木叶低剂量组(P<0.05);辣木叶高剂量组显著高于辣木叶中剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组水迷宫实验结果及NF-κB通路蛋白表达比较

2.2辣木叶提取液对VD小鼠海马组织损伤的影响 对照组海马神经元清晰,细胞核大而圆,位于细胞中央。VD组海马神经元表现为核凝聚、空泡化、炎症细胞浸润。辣木叶低剂量组核凝聚、空泡化情况较VD组有所减轻。辣木叶中剂量组核凝聚、空泡化情况显著减少。辣木叶高剂量组海马组织神经元基本恢复,仅有少量空泡化。见图1。

图1 HE染色检测辣木叶提取液对VD小鼠海马组织损伤的影响(小图×400,大图×200)

2.3辣木叶提取液对VD小鼠氧化应激水平的影响 5组海马组织中SOD和MDA水平差异显著(P<0.05)。VD组较对照组SOD水平显著降低,而MDA显著升高(P<0.05)。辣木叶提取液干预后,3组SOD显著升高,而MDA显著降低(P<0.05),其中SOD水平辣木叶高剂量组>辣木叶中剂量组>辣木叶低剂量组;MDA水平辣木叶高剂量组<辣木叶中剂量组<辣木叶低剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组氧化应激水平mTOR和Cdc42水平

2.4辣木叶提取液对VD小鼠NF-κB通路的影响 5组NF-κB通路水平比较差异显著(P<0.05)。VD组的IKK、NF-κB mRNA和蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)。辣木叶低剂量组显著低于VD组(P<0.05);辣木叶中剂量组显著低于辣木叶低剂量组(P<0.05);辣木叶高剂量组显著低于辣木叶中剂量组(P<0.05)。见表1、图2。

1～5:对照组、VD组、辣木叶低、中、高剂量组

2.5辣木叶提取液对VD小鼠mTOR和Cdc42表达水平的影响 5组mTOR和Cdc42转录和翻译水平比较差异显著(P<0.05)。VD组的mTOR、Cdc42 mRNA和蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05)。辣木叶低剂量组显著高于VD组(P<0.05);辣木叶中剂量组显著高于辣木叶低剂量组(P<0.05);辣木叶高剂量组显著高于辣木叶中剂量组(P<0.05)。见图2、表2。

3 讨 论

缺血-再灌注是诱发VD的主要原因之一,其发病率逐年攀升〔9〕。VD的发病机制涉及胆碱能系统、氧化自由基产生、一氧化氮、兴奋性氨基酸等多方面损伤,且与认知功能相关〔10〕。目前关于VD的治疗主要通过改善脑循环和脑代谢、脑保护、 抗氧化及增强脑内神经系统功能来实现,但临床上尚无治疗VD的特效药物。

VD临床表现包括认知功能障碍、人格改变和记忆功能减退,VD还会增加脑卒中死亡率,延长恢复期,并增加经济负担〔11〕。氧化应激是VD的重要机制,研究显示缺血-再灌注损伤、高龄、吸烟、血压异常等是VD的主要诱因,而这些损伤均会造成脑组织中氧化-抗氧化失衡,引起SOD降低和MDA升高〔12〕。而氧化应激反应不但会促进炎性反应损害海马神经元,还会导致神经元凋亡,从而引起神经功能障碍〔13〕。文献证明,辣木具有抗氧化、提高记忆力、促进神经元存活等作用,在辣木的不同部位中,叶的抗氧化活性最强,研究显示,辣木叶可通过抗氧化调控细胞的存活和凋亡〔14〕。Adebayo等〔15〕研究结果显示,辣木叶的生物氧化锌纳米粒子通过调节氧化应激和乙酰胆碱酯酶活性消除鱼藤酮诱导的神经内分泌毒性。动物研究结果显示,长期食用辣木叶补充饮食可促进抗氧化能力、增强大鼠海马的神经认知并保护神经功能〔16〕,本研究结果提示,辣木叶提取液能够改善VD小鼠神经功能,促进海马组织中SOD水平并抑制MDA水平,且随着辣木叶提取液干预剂量的升高,保护作用更显著。本研究结果说明,辣木叶提取液能够显著改善VD小鼠学习记忆功能,且抑制海马组织中氧化应激水平。

NF-κB通路与氧化应激和神经元损伤密切相关,一方面NF-κB会调控mTOR表达,进而调控下游SOD、MDA水平,从而调节氧化应激〔17,18〕;另一方面,氧化应激会激活IKK和NF-κB促进炎性损伤和神经元凋亡,引起海马体受损〔19〕。mTOR作为信号通路的效应分子,其通过活化后介导下游信号通路,调节细胞生长和增殖〔20〕。Cdc42是质膜相关小GTP酶,调控活性GTP结合状态和非活性GDP结合状态之间循环,在活跃状态下与多种效应蛋白结合以调节细胞反应,研究显示其是反映海马体功能的关键蛋白,Cdc42降低提示海马神经元功能受损〔21〕。本研究结果显示,VD小鼠海马神经元中NF-κB通路升高,而mTOR、Cdc42水平降低,而辣木叶提取液能够抑制IKK、NF-κB转录和翻译,促进mTOR、Cdc42 mRNA和蛋白的表达,且高剂量辣木叶提取液的干预作用更显著。Abdel-Daim等〔22〕研究表明,辣木叶提取物会通过 NF-κB 信号通路缓解钴介导的氧化损伤和炎症保护大鼠肾脏组织。本研究结果提示,辣木叶提取液能够调控氧化应激反应,抑制NF-κB通路,促进mTOR和Cdc42蛋白表达,从而促进海马神经元存活并帮助维持神经元功能,从而缓解VD。

综上,辣木叶可能通过调控VD小鼠氧化应激状态,抑制NF-κB通路,引起海马中mTOR、Cdc42表达增加,进而减少细胞凋亡数,保护受损神经元细胞,从而改善学习记忆功能。然而,本研究结果初步得到辣木叶能够保护VD小鼠神经功能的机制可能与NF-κB通路有关,仍需体内或体外验证实验,此外,辣木叶提取液缓解VD的作用和安全性仍需临床研究。