miR-630靶向Slug信号通路影响人肾癌细胞株侵袭、迁移的作用

孙伟 张炜 付桥 胡志 徐律 褚浩 王潇

(武汉市第三医院泌尿外科,湖北 武汉 430000)

肾癌是我国常见的一种泌尿系统恶性肿瘤。4.4/10.0万是肾癌在全球范围内的年龄标准化发病率,且近年来我国肾癌发病率和死亡率逐年上升,已成为严重的公共卫生问题〔1,2〕。目前肾癌的放化疗效果均不佳,根治性肾切除手术仅针对局限性肾癌有效,晚期肾癌患者虽可采用药物靶向治疗,但因肾癌恶性程度高、进展速度快、治疗复杂性高等特点导致治疗总体预后差、疗效不佳且死亡率高,同时肿瘤的复发和转移严重威胁患者生命健康〔3,4〕。因此探索更高效的分子靶向治疗药物和肾癌侵袭转移分子标记对于肾癌的治疗具有重要意义。恶性肿瘤常伴随上皮细胞-间充质转化,在肿瘤的转移和复发中发挥重要作用〔5〕。锌指转录因子Slug是一种具有锌指结构的上皮细胞-间充质转化转录因子,作为E-钙黏蛋白(cadherin)的抑制因子参与调控癌细胞侵袭和迁移〔6〕,研究发现药物治疗后下调Slug信号通路可抑制肾癌细胞侵袭和迁移〔7〕。微小核糖核酸(miR)-630参与调节肿瘤的发生与发展,据报道,miR-630过表达对食管癌细胞的侵袭和迁移有抑制作用〔8〕。然而又有研究指出,miR-630在肾癌中发挥促癌作用,抑制miR-630表达可抑制肾癌细胞侵袭和转移〔9〕,且有临床研究表明,miR-630在肾癌组织中的表达显著高于正常组织,高表达miR-630与肾癌患者预后不良密切相关〔10〕。miR-630靶向Slug可抑制甲状腺癌细胞侵袭能力〔11〕。但miR-630对肾癌细胞发展的影响是否与Slug信号通路相关还不明确。故本研究以肾癌ACHN细胞株为研究对象,对miR-630在肾癌ACHN细胞中的作用和靶点Slug信号通路进行了系统的分析和研究,旨在为肾癌临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1实验细胞与试剂 人肾癌细胞株ACHN,上海雅吉生物科技有限公司;携带miR-630 inhibitor(序列:5′-ACCUUCCCUGGUACAGAAUACU-3′)慢病毒、携带miR-630抑制剂阴性对照慢病毒(NC inhibitor,序列:5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)、miR-630 mimics阴性对照(NC mimics,正义链5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反义链5′-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3′)、携带miR-630模拟物(miR-630 mimics,序列:正义链5′-AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU-3′,反义链5′-ACGUGACACG UUCGGAGAATT-3′)慢病毒、野生型和突变型Slug-3′非翻译区(UTR)报告基因质粒(野生型pMIR-Report-Luc-Slug、突变型pMIR-Report-Luc-Slug),伊莱博生物科技(上海)有限公司;小鼠抗人E-cadherin(C1817)、N-cadherin(17-3904M)、Vimentin(ab97046)、Slug(ab27568)、磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(ab8245,一抗)、兔抗小鼠E-cadherin(ab76055)、N-cadherin(ab280375)、Vimentin(ab92547)、Slug(ab78105)、GAPDH辣根过氧化物酶标记多克隆抗体(LS-C66774,二抗),上海信帆生物科技有限公司;总RNA提取试剂盒(批号:15596026),美国Thermo;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(69-97682),武汉默沙克生物科技有限公司;E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Slug、miR-630和GAPDH聚合酶链反应(PCR)引物,圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司;侵袭小室(Transwell)板、基质胶(北京萌壮科技有限公司,生产批号:3421、356234);结晶紫(美国AMRESCO,生产批号:0528-500G);双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027),上海碧云天生物技术有限公司。

1.2仪器 XSP-GX8F荧光显微镜(上海光学仪器六厂);CKX53倒置显微镜(日本奥林巴斯);TG-16W型离心机(山东博科生物产业有限公司);JY02G型凝胶成像仪(北京海富达科技有限公司);GT100型荧光定量PCR仪(北京同洲维普科技有限公司);Quantity One4.5.6软件(美国Bio-Rad公司);ImageJ软件(美国国立卫生研究院);EnVision型多功能酶标仪(英国珀金埃尔默)。

1.3细胞培养传代、转染及分组 人肾癌ACHN细胞株在杜氏改良培养液(DMEM)培养,培养基中添加10%胎牛血清。细胞保存在含有5%CO2的37 ℃潮湿气氛中。将对数期ACHN细胞接种到24孔板,待其达到80%融合时,分别转染pGFP-hsa-NC inhibitor慢病毒、pGFP-hsa-miR-630 mimics慢病毒和pGFP-hsa-miR-630 inhibitor慢病毒,依次记为阴性对照组、过表达组、低表达组,以未转染的ACHN细胞作为正常组,具体操作步骤依据慢病毒转染说明书进行。转染后48 h,各组ACHN细胞在荧光显微镜观察转染效率。

1.4Transwell小室实验检测各组细胞侵袭能力 转染后的各组ACHN细胞继续培养48 h,采用Transwell法检测肾癌细胞株ACHN侵袭活性。细胞消化后,6 000 r/min(离心有效半径为7 cm)离心5 min,用不含胎牛血清的DMEM重悬细胞,调整细胞浓度为5×105个/ml,将100 μl细胞悬液置于预铺基质胶的Transwell小室上室,下室中添加含10%胎牛血清的培养基500 μl。孵育48 h后,细胞用4%多聚甲醛固定,再用0.5%结晶紫染色20 min,最后在倒置显微镜下计数穿膜细胞数。

1.5划痕实验检测各组细胞迁移能力 转染后各组细胞继续培养48 h,采用划痕实验检测各组细胞迁移活性。标记笔在6孔板背后每隔0.5 cm画一道横线,每孔至少穿过5条线。每孔加入约1×106个细胞。24 h后使用10 μl枪头在单层细胞上划痕,磷酸盐缓冲液(PBS)冲掉划下的细胞,加无血清RPMI1640培养液,37 ℃、5%CO2培养。在0、48 h时倒置显微镜拍照,应用Quantity One4.5.6软件分析各组划痕间距。

1.6实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-630表达及Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA表达 转染后各组细胞继续培养48 h,提取其总RNA,逆转录合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)后进行PCR扩增。扩增条件:95 ℃,8 min;95 ℃,8 s;63 ℃,15 s;72 ℃,15 s;40个循环。采用2-ΔΔCt计算待测基因的相对表达量〔12〕。引物序列:miR-630上游引物5′-AACTTAACATCATGCTACCT-3′,下游5′-TATAGTTAAGAACTACCTT-3′;Slug上游引物5′-CCTGGTTGCTTCAAGGACAC-3′,下游5′-TCCATGCT CTTGCAGCTCTC-3′;E-cadherin上游引物5′-TTAAACTCCTGGCCTCAAGCAATC-3′,下游5′-TCCTAT CTTGGGCAAAGCAACTG-3′;N-cadherin上游引物5′-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCAGC-3′,下游5′-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAGG-3′;Vimentin上游引物5′-TTGAACGCAAAGTGGAATC-3′,下游5′-AGGTCAGGCTTGGAAACA-3′;GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.7Western印迹法检测各组Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达 细胞用冷PBS洗涤,在哺乳动物蛋白提取试剂RIPA缓冲液中溶解,并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白浓度进行定量,10 μg/μl为蛋白终浓度。每组4 μl蛋白加到上样孔中进行电泳,转膜,加入一抗(小鼠抗人Slug、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH单克隆抗体稀释倍数分别为1∶500、1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶500),4 ℃孵育过夜,室温下孵育兔抗小鼠E-cadherin、Slug、N-cadherin、Vimentin、GAPDH二抗(稀释倍数分别为:1∶500、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶500)后,显影反应,采用凝胶成像仪拍照,ImageJ软件分析蛋白印迹灰度值。

1.8双荧光素酶报告基因检测验证miR-630是否靶向Slug信号通路 利用TargetScan8.0数据库〔13〕检测miR-630靶基因。将肾癌细胞株ACHN接种至96孔板中,待细胞融合度达到80%时进行质粒转染,将0.1 μg/孔野生型pMIR-Report-Luc-Slug报告基因质粒和20 nmol/L miR-630 mimics共转染至肾癌细胞株ACHN,同样将0.1 μg/孔突变型pMIR-Report-Luc-Slug报告基因质粒和20 nmol/L miR-630 mimics共转染至肾癌细胞株ACHN。同时分别设置野生型pMIR-Report-Luc-Slug质粒和NC mimics共转染组、突变型pMIR-Report-Luc-Slug质粒和NC mimics共转染组为对照。转染48 h后,PBS洗涤细胞,加入裂解液缓冲液裂解细胞,多功能酶标仪测量荧光强度。结果以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶荧光强度的比值表示。

1.9统计学分析 采用SPSS23.0软件进行方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组ACHN细胞转染效率 转染成功细胞在荧光显微镜下为绿色荧光,未转染成功细胞在荧光显微镜下无荧光。阴性对照组、过表达组和低表达组的转染效率依次为(87.39±17.36)%、(86.11±17.01)%、(85.43±16.98)%,各组间转染效率差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组肾癌ACHN细胞株转染后荧光(×200)

2.2各组细胞侵袭能力 与阴性对照组、正常组比较,过表达组穿膜细胞数量明显升高(P<0.05);与阴性对照组、正常组和过表达组比较,低表达组穿膜细胞数量明显降低(P<0.05)。见图2、表1。

表1 各组miR-630 mRNA及穿膜细胞数、划痕间距比较

图2 各组细胞侵袭能力Transwell小室实验结果(结晶紫染色,×100)

2.3各组ACHN细胞迁移能力 48 h时,与阴性对照组、正常组比较,过表达组划痕间距明显减小(P<0.05);与正常组、阴性对照组和过表达组比较,低表达组划痕间距明显增加(P<0.05)。见表1、图3。

图3 各组细胞划痕实验(×100)

2.4各组ACHN细胞miR-630、Slug、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin mRNA表达比较 与阴性对照组、正常组比较,过表达组miR-630、Vimentin和N-cadherin mRNA表达显著增高,E-cadherin和Slug表达显著降低(P<0.05);与阴性对照组、正常组和过表达组比较,低表达组miR-630、N-cadherin和Vimentin mRNA表达显著降低,E-cadherin和Slug mRNA表达显著增高(P<0.05)。见表1、表2。

表2 各组Slug、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表达比较

2.5各组ACHN细胞Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达比较 与阴性对照组和正常组比较,过表达组Vimentin和N-cadherin蛋白表达明显增高,E-cadherin和Slug蛋白表达明显降低(P<0.05);与阴性对照组、正常组和过表达组比较,低表达组Vimentin和N-cadherin表达明显降低,E-cadherin和Slug表达明显增高(P<0.05)。见表2、图4。

图4 各组Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达

2.6miR-630靶向Slug信号通路验证 miRNA靶基因预测Slug为miR-630潜在靶基因。miR-630与Slug的3′UTR区碱基互补配对序列见图5。在转染野生型pMIR-Report-Luc-Slug质粒细胞中,miR-630 mimics组相对荧光强度比NC mimins组明显低(P<0.001);miR-630 mimics组与NC mimins组相比,转染突变型pMIR-Report-Luc-Slug质粒细胞相对荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 双荧光素酶报告基因检测结果

图5 miR-630与其潜在靶基因Slug-3′UTR碱基互补序列

3 讨 论

肾癌的发病诱因包含遗传易感性或遗传性疾病、肥胖、吸烟、各种对肾脏有毒的工业化学品、药物和天然或人造放射性〔14〕。目前肾癌手术治疗多选择根治性肾切除,对于早期患者而言大多可痊愈,但肾癌初始阶段很难诊断,通常发现时已经处于晚期,因此手术治疗具有很大局限性;对于晚期肾癌患者通常使用药物治疗,尽管目前临床已出现大量靶向药物,但治疗效果有限,5年生存率仅12%,且存在肾功能不全、肾衰竭等后遗症、治疗周期长等问题〔15,16〕。因此探索针对肾癌治疗的关键靶点,寻找更高效、更特异的药物对于肾癌的治疗至关重要。

以往癌症报道显示,miR-630功能具有多向性,在不同细胞环境中发挥不同作用,王青安子等〔17〕指出,miR-630可抑制子宫内膜癌细胞侵袭和迁移,发挥抑癌作用;但王智宇等〔18〕指出,miR-630可促进膀胱尿路上皮癌细胞侵袭和转移,发挥促癌作用;赵建军〔19〕指出,miR-630在肾癌组织中表达水平显著高于癌旁组织,且在肾癌细胞系ACHN中表达水平高于肾小管上皮细胞系,抑制miR-630表达可抑制肾癌细胞生长并促进其凋亡。本研究结果证明,miR-630可提高肾癌细胞侵袭和迁移能力。Cui等〔20〕指出,miR-630过表达通过激活核转录因子(NF)-κB通路促进卵巢癌细胞侵袭和转移,而Chen等〔21〕指出,miR-489-3p和miR-630协同作用靶向有机阳离子转运蛋白2发挥抑制肾癌作用,提示miR-630在肾癌中可能参与调节多个信号通路,不同信号通路组成网络、相互作用,共同调节细胞行为,而本研究中miR-630的促癌作用占主导地位,因此发挥促癌作用。

上皮细胞-间充质转化在癌症转移过程中发挥重要作用,研究表明抑制肺癌上皮细胞-间充质转化可抑制癌细胞迁移、侵袭〔22〕。Slug是E-cadherin的抑制因子,N-cadherin和Vimentin共同调控恶性肿瘤中上皮细胞-间充质转化,调控肿瘤细胞的侵袭和转移。本实验结果提示,miR-630可能是通过靶向调控Slug促进肾癌上皮细胞-间充质转化发挥促癌作用。李建新等〔23〕指出,miRNA-3915靶向抑制Slug信号通路可抑制肾癌细胞侵袭和迁移作用;冯顶威等〔24〕指出,在肺癌中促进N-cadherin和Vimentin表达,抑制E-cadherin表达,可促进肺癌细胞上皮细胞-间充质转化、促进肺癌细胞迁徙和侵袭。本研究与前述Slug相关研究结果相反,与N-cadherin、E-cadherin和Vimentin相关研究结果一致。Chen等〔25〕指出,肝癌细胞中miR-630靶向Slug抑制肝癌细胞转移,本研究结果与该研究结果相反,首次证实miR-630可通过靶向Slug信号通路促进肾癌转移。

综上,miR-630可能通过调节Slug信号通路,抑制E-cadherin表达,促进N-cadherin和Vimentin表达发挥促进肾癌细胞侵袭和迁移作用。本研究初步阐释了miR-630对人肾癌细胞株侵袭和迁移的作用和机制,为临床治疗肾癌分子靶向药物的研发提供了实验依据。