基于HIF-1α/VEGF通路探讨土家族麝针疗法“活血生新”干预缺血性脑卒中大鼠的作用机制

余秀 涂星,3 陈嘉碧 袁丽君 李三宇 陈通华 李鸿 张钰

(湖北民族大学 1风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室,湖北 恩施 445000;2医学部;3武陵山中药材检验检测中心)

缺血性脑卒中临床表现为猝然昏仆、人事不知、口眼歪斜、语言不利等〔1～3〕。缺血性脑卒中作为世界第二死因与第一致残原因,其致死率仅次于缺血性心脏病,给个人和社会带来沉重的负担〔4〕。

土家族麝针疗法是土家族民间流传甚久的一种常用治疗方法,用于穿刺疖肿脓疱、针刺穴位、局部放血等〔5〕。前期研究表明〔6～8〕,土家族麝针疗法对缺血性脑卒中大鼠的血液循环具有较好的改善作用,可以促进缺血性脑卒中大鼠的神经运动功能的改善,其通过调节血清、血浆中的细胞因子可以改善脑部缺血的状态,从而减少缺血对脑部的损伤,达到脑保护的作用,其作用机制可能与麝针具有芳香化浊、通筋脉、行气滞、散瘀血作用有关。

在缺血性脑卒中早期,缺氧诱导因子(HIF)-1α可促使细胞凋亡,在后期则促使细胞增殖,因此HIF-1α可能属于双向调节因子。HIF-1α磷酸化后可激活血管内皮生长因子(VEGF)等抗凋亡基因,一方面促进微血管和侧支循环的形成,增加脑血流量,同时刺激神经元细胞增殖、分化等,起到脑保护作用〔9〕。VEGF具有促进血管内皮细胞分裂、诱发血管形成及增加血管通透性的功能,在缺氧条件下,VEGF作为HIF-1α的靶基因之一,被HIF-1α诱导而转录激活〔10,11〕。

缺血性脑卒中在损伤机制与缺血缺氧的情况下,泛素会被HIF-1α激活上调HIF-1α,进而促进了VEGF的表达释放,导致血管内皮细胞的增殖分裂与VEGF受体(VEGFR)2结合,使Src蛋白过度释放,进而导致一氧化氮合酶(NOS)的释放改变,从而使血管的通透性和血管的新生增强,达到改善缺血性脑卒中的目的。因此,调控HIF-1α/VEGF通路可能促进缺血性脑卒中的康复。但土家族麝针疗法治疗缺血性脑卒中大鼠的作用机制是否与HIF-1α/VEGF通路表达有关,未见相关报道。本研究通过研究HIF-1α/VEGF通路探讨土家族麝针疗法干预缺血性脑卒中模型(MACO)大鼠的作用机制。

1 资料与方法

1.1实验动物 清洁级SD雄性大鼠80只,5～7周龄,体质量(200±20)g,购于湖北省实验动物中心,许可证号:SCXK(鄂)2015-0001。饲养环境温度(22±2)℃,湿度50%～70%,12 h/12 h光暗体系。

1.2药品及试剂 土家族麝针(实验室自制,专利号:201720035406.2);水合氯醛(CP,批号:150307,广州化学试剂厂);大鼠蛋白激酶A ELISA试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司);通用型二抗试剂盒、β-actin抗体、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉生物试剂公司);VEGFR2一抗(美国 Abcam),电化学发光(ECL)超敏发光试剂盒(美国Thermo);酪氨酸蛋白激酶家族成员(Src)抗体(Cell Signaling Technology公司);其他试剂均为分析纯。

1.3主要仪器 Western印迹电泳及转膜装置(国Bio-Rad公司);TU-1901紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);酶标定量测定仪(德国Thermo公司);PELAMB DABIO 20双光束紫外分光光度计(美国PerkinElmer公司);5810R 高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);TS-Ⅰ型摇床(江苏海门麒麟医用仪器厂)。

1.4实验方法

1.4.1缺血性脑卒中大鼠模型的制备及筛选 根据文献〔6～8〕,取80只SD大鼠,随机分成模型组(n=60),假手术组(n=20)。水合氯醛以3 ml/kg剂量麻醉后大鼠,颈部正中纵行切口切开皮肤,依次分离肌肉及皮下组织,暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,结扎颈总动脉、颈外动脉,经切口插入制备好的栓线,经过颈总动脉分叉处、颈内动脉进入颅底至较细的大脑前动脉,阻断颈内动脉、大脑前动脉及大脑后动脉血流供应,固定线栓后逐层缝合皮肤,回笼饲养。假手术组仅给予假手术而不进行线栓栓塞及结扎。按照 Zea-longa 5级评分法〔12〕对造模大鼠进行评分,选取评分为 1～3 分的造模大鼠作为成功的模型大鼠。最后大鼠造模组共成功45只,假手术组成功15只。

1.4.2缺血性脑卒中大鼠模型的分组与治疗〔6～8〕将造模成功的大鼠随机分为麝针组、针刺组、模型组,每组15只,另取假手术组15只。

1.4.3神经运动功能评价 通过平衡木实验〔13〕来检测大鼠的运动功能。平衡木长 100 cm,宽2 cm,高80 cm,两端各有一平台,大鼠放置在平衡木上,观察120 s,根据大鼠在平衡木上表现评分,得分越高说明平衡能力越差。于治疗前和每个疗程后每组随机取6只大鼠测试。

1.4.4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中 HIF-1α、VEGF含量 取备测血浆,室温复溶后采用ELISA检测血浆中 HIF-1α、VEGF含量,具体操作按照试剂盒进行。

1.4.5Western印迹检测海马组织中VEGFR2和Src蛋白表达 取备测蛋白样品,室温复溶后采用Western印迹检测VEGFR2和Src蛋含量,具体操作按照试剂盒进行。

1.5统计学处理 采用SPSS20.0软件进行t检验、方差分析,两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组运动功能恢复情况 治疗前,与假手术组比较,模型组、麝针组、针刺组运动功能皆显著下降且各组间无明显差异(P<0.05);经过治疗后,随着疗程增加,各造模组平衡木测试评分不同程度降低(P<0.05),且麝针组运动功能恢复更明显(P<0.05)。见表1。

表1 不同疗程各组平衡木测试评分分)

2.2各组血浆中HIF-1α、VEGF的含量 治疗前,与假手术组相比,各造模组血浆中HIF-1α、VEGF含量显著升高(P<0.05),且各造模组无显著差异(P>0.05)。经过3个疗程治疗后,各造模组血浆中HIF-1α、VEGF含量较治疗前明显升高(P<0.05);与模型组比较,麝针组及针刺组血浆中HIF-1α、VEGF含量均显著升高(均P<0.05)。见表2。

表2 各组血浆HIF-1α、VEGF含量及海马VEGFR2、Src蛋白表达

2.3海马组织中VEGFR2、Src蛋白表达的变化 治疗3个疗程后,与假手术组相比,模型组、针刺组和麝针组VEGFR2、Src蛋白相对表达量均显著升高且各组间差异显著(P<0.05)。与模型组比较,针刺组和麝针组海马中VEGFR2蛋白表达量明显升高,麝针组Src蛋白表达量明显降低(均P<0.05),与针刺组比较,麝针组海马中VEGFR2蛋白表达量显著升高,Src蛋白表达量明显降低(均P<0.05)。见表2、图2。

图2 各组海马组织中VEGFR2、Src蛋白表达

3 讨 论

缺血性脑卒中是临床上常见的脑血管疾病,脑组织作为人体需氧量和需血量最高的器官,一旦由于脑血管狭窄或闭塞使脑血流阻断而导致一过性的缺血或者缺氧,就极易引起脑组织缺血缺氧性软化甚至坏死,进而能引起中枢神经系统大量神经细胞损伤,从而出现长期的神经功能障碍〔14～16〕。但现代研究〔17,18〕发现,脑损伤后神经功能具有一定自发恢复能力,可能与中枢神经系统损伤早期脑神经的可塑性有关。

缺血性脑卒中大鼠在缺血缺氧的情况下,HIF-1α 表达随着脑组织缺氧加重而升高,而HIF-1α可以调控多个下游靶基因,其中VEGF作为最有效的血管生成因子之一,可以介导内皮细胞增殖,导致血管内皮细胞的增殖分裂与VEGFR2结合,使Src过度释放,进而导致NOS的释放改变,减少脑部因缺血缺氧所致的损伤,起到脑保护作用,从而达到改善缺血性脑卒中的目的。

本研究结果显示,土家族麝针疗法促进缺血大鼠运动功能的康复、改善脑部血流情况的作用可能是通过激活HIF-1α/VEGF信号通路实现的。