温润通脉方调控氧化应激水平对充血性心力衰竭大鼠心肌的保护作用

贾运时 刘琪 马秀娟 宋温婷 付玉娜 陈华

(1石家庄市中医院心病二科,河北 石家庄 050051;2河北省人民医院)

充血性心力衰竭是由遗传、能量代谢等多种因素共同参与,导致心脏泵血功能降低、血液运行迟滞的一种临床多发疾病。主要特征为心排血量降低及血液灌流减少等,故又称心功能不全〔1,2〕。该病具有高发病率、高致残率及高死亡率,且随着年龄的增加,患病风险也随之上升,这对患者的生命健康造成了极大威胁,因此探寻一种有效的防治手段已成为医学界重点关注的课题之一〔3,4〕。充血性心力衰竭的病因复杂,目前尚不完全明确,目前已知的主要有心肌重塑、微循环障碍、趋化因子及神经内分泌激活和心肌细胞凋亡等几个方面〔5〕。研究表明,氧化应激在心血管系统结构和功能异常中发挥重要作用,其产生的过量氧自由基会对心肌细胞膜造成损伤,从而促进心室重构并造成心肌能量代谢缺陷,最终加重心肌损伤,因此抑制氧化应激反应理论上可延缓心力衰竭病情的发展〔6〕。目前,临床上治疗充血性心力衰竭多为西药治疗,但效果并不理想,存在副作用大、长期预后效果欠佳等问题,而中医作为我国传统医学,其具有完整的理论体系,且安全性高,在心力衰竭方面具有广阔的发展前景〔7,8〕。温润通脉方是由炒白芍、桂枝、茯苓及炙甘草四药配伍的传统中药方剂,其具有补益心阳、调和营血、温通血脉、化阴养血,温润通脉之效〔9〕。而心力衰竭正是心阳不足、虚衰而竭、血行不畅等原因所致,但目前临床有关其对心力衰竭的研究几近于无,因此本文就温润通脉方调控氧化应激水平对充血性心力衰竭大鼠心肌保护作用进行研究探讨,为临床治疗缺血性心力衰竭提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1实验动物 北京亿鸣复兴生物科技有限公司提供的60只SPF级SD大鼠〔合格证书为:SCXK(京)2018-0006〕,体质量250～300 g,单笼喂养,室温生长,无菌自由进食、进水2 w,按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.2试剂与仪器 参芪益心汤、温润通脉汤均由医院煎剂室提供。硫辛酸(批号:SND-1705)购自滁州仕诺达生物科技有限公司。生物机能实验系统、大小鼠便携式彩色多普勒超声成像仪(型号:MyLab)均购自上海玉研科学仪器有限公司。德国Eppendorf公司高速冷冻离心机(型号:5024R)。日本OLYMPUS公司光学显微镜(型号:CX-60)。德国Leica公司自动包埋机(型号:EG1150)。Sigma-AldrichLLC.公司多聚甲醛(批号:158127)。上海一研生物科技有限公司苏木素染液(批号:EY-19374)。上海吉至生化科技有限公司伊红染液(批号:AG1100-100 ml)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(批号:446502)购自美国R&D公司。南京德铁实验设备有限公司全波长酶标仪(批号:HBS-ScanX)。放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解液(批号:SY4680)、生理盐水(YT3740)均购自北京伊塔生物科技有限公司。江苏凯基生物科技发展有限公司的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、电化学发光(ECL)检测试剂盒(批号:KGP113、KGP1123)。超氧化物歧化酶(SOD)抗体(批号:PL0402056)购自深圳豪地华拓生物科技有限公司。丙二醛(MDA)抗体(批号:PAB14355)购自上海群己生物科技有限公司。GAPDH抗体(批号:10094-MM09-50)购自北京义翘神州科技股份有限公司。

1.3模型制备与分组 选取40只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常(N)组,模型(M)组,参芪益心方(S)组,温润通脉方(W)组,每组10只。M、S、W组进行充血性心力衰竭建模大鼠给予腹腔注射盐酸阿霉素,共注射6 w,单周注射剂量为3 mg/kg,双周注射剂量为2 mg/kg,每周注射1次,注射完成后,用彩超测定计算出左心指数,当左心指数≤180 ml/(min·kg)时视为建模成功,N组建模,同期给予同体积生理盐水。建模成功后,S组灌胃参芪益心汤20 g/kg,W组灌胃温润通脉汤6 g/kg,1次/d,N组、M组同期灌胃同体积生理盐水,持续28 d。

1.4血流动力学测定 给药完成后用生物机能实验系统测量各组大鼠心率(HR)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)等血流动力学参数。

1.5心肌功能测定 由电检科医生为各组大鼠做彩色超声多普勒心动图,测定左室收缩末期内径(LVSD)、左室舒张末期内径(LVDD)、室间隔(IVS)、左心室劳损(LVS)、左室射血分数(LVEF),各项数值均经计算机处理后获得。

1.6标本采集 大鼠眼球取血5 ml,将其放入冷水浴冷却的酶抑制抗凝管中,摇匀后冷藏2 h,2 500 r/min离心7 min,弃掉上清液,得血浆样品放入冰箱密封保存,同时取心肌组织,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后,用4%的多聚甲醛固定96 h,洗涤后在冰箱中密封保存。

1.7心肌组织病理检测 心肌组织常规石蜡包埋、切片,二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后苏木素-伊红(HE)染色,除去多余染液后,用梯度乙醇脱水、二甲苯透明,中性树胶封片处理后光学显微镜进行组织病理学观察。

1.8血浆SOD、MDA水平测定 采用ELISA检测,严格按照试剂盒说明操作,配制标准品,然后进行温育30 min、洗涤5次、加酶、再温育30 min、洗涤5次处理,拍干后在37 ℃下避光显色15 min,加入终止液终止反应,立即在450 nm波长处测定每孔吸光度,绘制标准曲线,根据SOD、MDA吸光度计算SOD、MDA水平。

1.9心肌组织中SOD、MDA蛋白表达检测 另取20只大鼠,建模后随机分为两组,一组给予灌胃60 mg/kg氧化应激抑制剂硫辛酸,记为O组,一组给予硫辛酸联合温润通脉汤,记为T组,免疫印迹法检测N、M、S、W、O、T组心肌组织中SOD、MDA蛋白,取心肌组织,清洗、剪碎后置于离心管中,加入RIPA裂解液,于冰上充分裂解10 min,10 000 r/min离心10 min,取上清液用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度用SDS-PAGE试剂盒进行电泳,其步骤为浓缩胶80 V 30 min,分离胶120 V 1 h,将凝胶上蛋白用半干法转移至甲醇活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,120 V转膜1.5 h,在7 ℃、5%BSA 条件下封闭2 h;按说明书用封闭液稀释一抗(1∶1 000),加入稀释的SOD、MDA一抗,4 ℃摇床振荡孵育过夜后洗膜;加入稀释的二抗( 1∶5 000),37 ℃轻摇室温孵育2 h;洗膜后,用电化学发光荧光试剂盒测定,以同一样本中的GAPDH作为内参,计算比值求得SOD、MDA蛋白的相对表达含量。

1.10统计学分析 采用GraphPad Prism8.0进行t检验、χ2检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组血流动力学结果 与N组相比,M组HR、SBP、DBP、LVSP、LVEDP均显著升高(P<0.05);与M组比较,S、W组HR、SBP、DBP、LVSP、LVEDP均显著降低(P<0.05),且W组比S组降低显著(P<0.05),见表1。

表1 各组血流动力学指标及血浆SOD、MDA水平比较

2.2各组血浆中SOD、MDA水平 与N组相比,M组血浆中SOD水平显著降低(P<0.05),MDA水平显著升高(P<0.05)。S、W组血浆中SOD水平较M组显著升高(P<0.05),MDA水平显著降低(P<0.05),W组比S组变化显著(P<0.05),见表1。

2.3各组心肌功能相关指标结果 与N组相比,M组LVSD、LVDD、IVS、LVS均显著升高(P<0.05),LVEF显著降低(P<0.05);与M组比较,S、W组LVSD、LVDD、IVS、LVS均显著降低(P<0.05),LVEF显著升高(P<0.05),且W组变化比S组显著(P<0.05),见表2。

表2 各组心肌功能相关指标比较

2.4各组心肌组织HE染色结果 N组心肌组织结构正常且排列整齐,细胞质纹理清晰,细胞核大小、形态基本一致,且未见间质细胞增生及明显坏死、萎缩等现象,而M组心肌组织结构明显松弛,心肌出现肌浆凝聚、核固缩,且有不同程度的颗粒及空泡变性,可见间质面积明显增大及出血,与M组相比,S、W两组症状明显改善,心肌组织结构趋向完整,且W组比S组改善明显,见图1。

图1 各组心肌组织(HE染色,×400)

2.5各组心肌组织中SOD、MDA蛋白表达 与N组相比,M组心肌组织中SOD蛋白表达显著降低(P<0.05),MDA蛋白表达显著升高(P<0.05);与M组比较,S、W组心肌组织中SOD蛋白表达显著升高(P<0.05),MDA蛋白表达显著降低(P<0.05),且W组变化比S组显著(P<0.05),而O组与W组相比无明显差异(P>0.05),T组比O组变化明显(P<0.05),见表3、图2。

图2 各组心肌组织中SOD、MDA蛋白表达

表3 各组心肌组织SOD、MDA蛋白表达比较

3 讨 论

本文结果说明,温润通脉方可显著改善充血性心力衰竭大鼠血流动力学。参芪益心方是经临床多年验证的有效治疗心力衰竭的中药方,该方紧扣心力衰竭的病因、病机,加入了人参、黄芪等具有保护心肌作用的中药,在活血利水、益气温阳等方面发挥重要作用〔10〕。而温润通脉方中炒白芍养血敛阴、柔肝止痛,桂枝能通经脉、助心阳、止悸动,茯苓可宁心安神、益心脾,炙甘草可益气复脉、补益心脾,此四方配伍正合仲景“病痰饮者,当以温药和之”之意〔11〕。现代研究表明,心力衰竭的基本发病机制是血流动力超负荷,导致机体内微循环出现紊乱,从而引起血管内皮功能受到损伤,进而加重局部脏器功能损伤,最终导致衰竭的出现〔12〕。而温润通脉方可能是通过降低心肌的自律性,抑制交感神经兴奋,来提高心脏做功效率,增加心排血量及心肌供氧,从而抑制神经体液细胞因子激活、抑制血管收缩、抑制醛固酮的分泌,进而降低HR及血压,有效缓解和逆转心肌重构情况,最终达到改善血流动力学的目的。董肖等〔13〕研究发现,益气通脉汤对慢性心力衰竭有显著疗效,可有效改善血流动力学指标,提高心脏供血能力,这与本文结果类似。

本研究表明,温润通脉方具有显著疗效,其可有效改善充血性心力衰竭大鼠的心肌功能,并对其起到一定保护作用。本文选择超声心动图来评价大鼠的心肌功能,是因为其在心脏影像学中居主导地位,是评价心脏结构及功能的重要手段,也是评估心力衰竭的唯一最有用的检查工具〔14〕。心力衰竭最主要的特征就是心室功能障碍及神经体液调改变,最终导致心肌功能受损,生存时间明显缩短,而心力衰竭并不能根治,只能通过药物治疗来达到缓解症状或维持现状的目的〔15〕。对于充血性心力衰竭大鼠,温润通脉方可能是通过扩冠、增加心肌灌流,来改善心肌舒张及收缩功能、增加心肺压力感受器敏感性,从而降低外周血管阻力、改善毛细血管的血液循环、降低心脏后负荷,进而降低心肌耗氧、抑制血小板聚集、降低心脏做功,最终抑制心室重构,改善大鼠疾病症状。研究发现〔16〕,养心通脉汤可显著改善患者心功能,并对其心肌起到一定保护作用,这与本文结果类似。

本研究说明,温润通脉方可显著抑制氧化应激。氧化应激是体内抗氧化与氧化作用失衡的一种状态,被认为是导致疾病和衰老的一个重要因素,而SOD及MDA是反映氧化应激状态的重要指标〔17〕。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶,是机体内氧自由基的头号杀手,可保护细胞免受自由基攻击,而MDA是细胞膜被氧化后形成的脂质过氧化物,其水平可以用来评估体内氧化应激程度和脂质过氧化损伤程度,在机体内脂质过氧化损伤中扮演重要角色〔18〕。心室重构是心力衰竭发生的核心基础,氧化应激损伤心肌细胞膜,从而改变离子通道,加重心肌纤维化及心肌细胞损伤,促进心室重构〔19〕。而对于充血性心力衰竭大鼠,温润通脉方可能是通过改善心肌收缩功能及心肌兴奋,来抑制钙离子的转运,并改善细胞膜的流动性及通透性,从而有效清除氧自由基、抑制细胞膜脂质过氧化、抑制部分蛋白酶的活性,进而抑制氧化应激水平,抑制心肌纤维化及心室重构,最终有效制止心力衰竭进一步恶。王从阳等〔20〕研究发现,温润通脉方可显著提高SOD活力,降低MDA水平,这说明其可显著抑制氧化应激水平,这与本文结果类似。

综上所述,温润通脉方对充血性心力衰竭大鼠具有显著疗效,可对心肌起到一定保护作用,其作用机制可能是通过抑制氧化应激来实现的。