天麻素调节cAMP/PKA/CREB信号通路对阿尔茨海默病大鼠认知障碍的影响

陈逢义 王艳平 向庆伟

(长江大学附属仙桃市第一人民医院 1神经内科,湖北 仙桃 433000;2眼科;3湖北省中医院老年病科;4湖北省中医药研究院;5湖北中医药大学附属医院)

阿尔茨海默病(AD)症状包括情绪变化、严重的记忆力减退和认知障碍〔1〕。病理学研究表明,AD患者大脑中存在β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块及以神经胶质细胞激活和存在各种炎症成分为特征的神经炎症〔2,3〕。尽管已经对AD治疗进行了许多研究,但寻找治愈该疾病的干预措施仍是一个挑战。天麻素(GT)作为天麻的主要生物活性成分,已有研究报道,GT可减轻AD大鼠海马CA1区神经元损伤,提高学习记忆能力〔4〕。提示GT具有改善AD大鼠认知障碍的作用。而关于GT改善AD大鼠认知障碍的具体机制尚不完全清楚。先前研究显示,环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶(PK)A/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)通路激活可减轻AD小鼠认知缺陷〔5〕。而GT能否通过调控cAMP/PKA/CREB通路减轻AD大鼠认知障碍尚不明确。本研究主要探究GT对AD大鼠认知障碍的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 60只雄性SPF级SD大鼠购自吉林大学(实验动物中心),生产许可证号:SYXK(吉)2021-0006。本研究得到医院动物伦理委员会的批准,所有动物实验遵循3R原则。

1.2主要试剂 GT(纯度≥98%,货号:XY21243)购自上海信裕生物公司;PKA抑制剂H-89(货号:KGR0043)购自江苏凯基生物公司;白细胞介素(IL-6,货号:SZ-HAS-336)、离子钙接头蛋白(IBA)-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号:HAS-49076)、链脲佐菌素(STZ,货号:18883-66-4)购自深圳海思安生物公司;大鼠cAMP ELISA试剂盒(货号:QN-PS2085)购自上海乔羽生物公司;兔源一抗Aβ42(货号:SFK079)购自上海士锋生物公司;兔源一抗p-PKA(货号:ab75991)、PKA(货号:ab216572)、p-CREB(货号:ab32096)、CREB(货号:ab32515)、β-actin(货号:ab8226)、Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔二抗(货号:ab150077)及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(货号:ab6728)均购自Abcam公司。

1.3AD大鼠模型构建及分组 AD大鼠模型构建〔6〕,用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠,固定头部,碘伏消毒,沿矢状线切开皮肤,暴露颅骨,用骨钻在前囟后1.0 mm、矢状缝旁开1.5 mm处钻孔,利用注射器将10 μl STZ溶液(3 mg/kg)缓慢注入脑室,注射后留针1 min,以同样方式将10 μl STZ溶液注入另一侧脑室,间隔2 d再向脑双侧注射STZ,缝合皮肤,连续注射5 d庆大霉素以防感染。NC组除向双侧脑室注射10 μl生理盐水外,其余操作同造模过程。将60只SD大鼠分为NC组、Model组、GT组、H-89组、GT+H-89组,每组12只。除NC组外,其他组均构建AD大鼠模型。建模成功后,第10天开始给药处理,GT组〔7〕灌胃300 mg/kg GT并腹腔注射5 mg/kg生理盐水,H-89组〔8〕腹腔注射5 mg/kg H-89并灌胃300 mg/kg生理盐水,GT+H-89组灌胃300 mg/kg GT,同时腹腔注射5 mg/kg H-89,NC组和Model组同时灌胃300 mg/kg生理盐水并腹腔注射5 mg/kg生理盐水,每天1次,持续4 w。

1.4标本收集 末次给药结束后,对各组进行认知障碍的评定;评定结束后,用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后处死,收集大鼠海马组织,分为两部分,一部分固定于4%多聚甲醛中,一部分冻存于液氮中。

1.5Morris水迷宫实验 测试大鼠空间学习能力:将大鼠放在任意一个入水点处,将大鼠游到平台的时间记录为逃避潜伏期,若在2 min内大鼠不能游到平台就引导其爬到平台,按照这种方式持续训练5 d,观察并记录第6天的逃避潜伏期。测试大鼠空间记忆能力:在第7天时撤去平台,将距平台最远的位置设置为入水点,观察并记录大鼠在2 min内穿台次数〔9〕。

1.6苏木素-伊红(HE)染色检测AD大鼠海马CA1区病理损伤 将固定在4%多聚甲醛中的海马组织样本进一步处理并包埋在石蜡中,用切片机获得5 μm切片。切片用苏木素和伊红染色后,利用光学显微镜观察切片病理学变化。

1.7免疫荧光检测海马Aβ42斑块沉积 将海马组织切片经脱蜡、磷酸盐缓冲液(PBS)平衡后,置于2 mol/L盐酸中,在37 ℃恒温摇床中孵育30 min,再在0.1 mol/L硼酸中孵育10 min后,用TBS洗涤。然后将切片用10%驴血清封闭1 h,加入一抗Aβ42(1∶300)在4 ℃温育过夜,洗涤后,加入Alexa Fluor488标记的二抗在常温下孵育1 h,用TBS洗涤后,将切片置于载玻片上,盖上盖玻片,利用荧光显微镜观察并拍照。

1.8ELISA检测海马组织中IL-6、IBA-1、cAMP水平 将海马组织用预冷的生理盐水进行匀浆,2 500 r/min离心10 min,取上清液。利用IL-6、IBA-1、cAMP试剂盒测定海马组织中IL-6、IBA-1、cAMP水平。

1.9Western印迹检测p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表达 利用RIPA裂解缓冲液提取海马组织匀浆中的总蛋白,将等量的蛋白质进行电泳、转膜、封闭,然后与一抗p-PKA(1∶2 000)、PKA(1∶1 000)、p-CREB(1∶2 000)、CREB(1∶2 000)、β-actin(1∶1 000)在4 ℃下过夜,再与山羊抗兔二抗共同孵育1 h后,加入ECL观察显色,利用ImageJ软件量化蛋白灰度值。

1.10统计学分析 采用SPSS19.0软件进行方差分析,两组间比较行SNK-q检验。

2 结 果

2.1GT对AD大鼠认知障碍的影响 与NC组比较,Model组逃避潜伏期明显延长,穿台次数明显减少(P<0.05);与Model组比较,GT组逃避潜伏期明显缩短,穿台次数明显增多,而H-89组对应指标呈相反变化趋势(P<0.05);与GT组比较,GT+H-89组逃避潜伏期明显延长,穿台次数明显减少(P<0.05),见表1。

表1 GT对AD大鼠认知障碍、Aβ42荧光强度、海马组织中IL-6、IBA-1、cAMP水平及p-PKA、p-CREB蛋白表达的影响

2.2GT对AD大鼠海马组织中IL-6、IBA-1水平的影响 与NC组比较,Model组IL-6、IBA-1水平明显升高(P<0.05);与Model组比较,GT组IL-6、IBA-1水平明显降低,而H-89组对应指标变化呈相反趋势(P<0.05);与GT组比较,GT+H-89组IL-6、IBA-1水平明显升高(P<0.05),见表1。

2.3GT对AD大鼠海马Aβ42斑块沉积的影响 与NC组比较,Model组海马Aβ42斑块沉积明显增多(P<0.05);与Model组比较,GT组海马Aβ42斑块沉积明显减少,而H-89组Aβ42斑块沉积明显增多(P<0.05);与GT组比较,GT+H-89组大鼠海马Aβ42斑块沉积明显增多(P<0.05),见表1、图1。

图1 各组海马Aβ42斑块沉积(免疫荧光染色,×200)

2.4GT对AD大鼠海马CA1区神经元损伤的影响 NC组海马CA1区神经元结构完整,排列整齐,着色均匀;Model组海马CA1区神经元结构不规则、排列紊乱、细胞核固缩、空泡化和坏死严重;与Model组比较,GT组海马CA1区神经元损伤有所缓解,而H-89组海马CA1区神经元损伤加剧;与GT组比较,GT+H-89组神经元损伤严重,见图2。

图2 各组海马CA1区神经元损伤(HE染色,×200)

2.5GT对AD大鼠海马组织中cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达的影响 与NC组比较,Model组cAMP水平、p-PKA、p-CREB蛋白表达显著降低(P<0.05);与Model组比较,GT组cAMP水平、p-PKA、p-CREB蛋白表达显著升高(P<0.05),H-89组cAMP水平变化无显著差异(P>0.05),p-PKA、p-CREB蛋白表达显著降低(P<0.05);与GT组比较,GT+H-89组cAMP水平变化无显著差异(P>0.05),p-PKA、p-CREB蛋白表达显著降低(P<0.05),见表1、图3。

图3 Western印迹检测p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表达

3 讨 论

AD是一种进行性神经退行性疾病,伴有神经炎症和认知能力下降,尽管多年来为寻找有效的治疗药物付出了巨大的努力,但目前仍未找到能够治愈AD的方法〔10〕。双侧脑室注射STZ可导致脑内Aβ沉积,进而损伤海马神经元造成学习与记忆能力下降,是构建AD模型常用的方法〔11〕。研究报道,Aβ42蛋白在AD大鼠海马组织中的表达明显高于正常大鼠〔12〕;IL-6作为重要的促炎细胞因子,在AD患者脑中呈高表达状态并诱导神经炎症导致神经元损伤,进而加剧小胶质细胞的活化,促进胶质细胞激活状态下的标志物IBA-1的表达〔13,14〕。本研究结果与上述结果一致。本研究提示,AD大鼠海马组织中Aβ42蛋白呈高表达。本研究还表明,AD大鼠海马组织中存在神经炎症。

GT可广泛用于预防和改善中枢神经系统疾病〔15〕。Chen等〔16〕报道,GT可改善血管性痴呆大鼠的学习和记忆障碍;刘德玲等〔17〕阐明GT可改善AD大鼠的学习记忆能力,具有一定的神经保护作用。表明GT具有改善认知障碍的作用。本研究结果与上述研究是一致的,本研究证实,GT能够改善AD大鼠认知障碍,GT对AD大鼠发挥保护作用。

cAMP/PKA/CREB通路是对记忆巩固至关重要的通路,该通路的抑制可能在一定程度上导致认知能力下降〔18〕。相关文献报道,激活cAMP/PKA/CREB通路可改善神经元损伤,进而提高D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠认知能力〔19〕;上调cAMP/PKA/CREB信号通路可改善AD小鼠认知行为和中枢病理损伤〔20〕。本研究结果证实,GT可能通过激活cAMP/PKA/CREB通路改善AD大鼠认知障碍。